Nature.com भ्रमण गर्नुभएकोमा धन्यवाद।तपाईंले प्रयोग गरिरहनुभएको ब्राउजर संस्करणमा सीमित CSS समर्थन छ।उत्तम अनुभवको लागि, हामी तपाईंलाई अपडेट गरिएको ब्राउजर प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं (वा इन्टरनेट एक्सप्लोररमा अनुकूलता मोड असक्षम गर्नुहोस्)।यस बीचमा, निरन्तर समर्थन सुनिश्चित गर्न, हामी शैली र जाभास्क्रिप्ट बिना साइट रेन्डर गर्नेछौं।
पल्मोनरी सिस्टिक फाइब्रोसिसको उपचारको लागि जीन भेक्टरहरू प्रवाहकीय वायुमार्गहरूमा लक्षित हुनुपर्छ, किनकि परिधीय फोक्सोको ट्रान्सडक्शनले कुनै उपचारात्मक प्रभाव पार्दैन।भाइरल ट्रान्सडक्शनको दक्षता सीधा क्यारियरको निवास समयसँग सम्बन्धित छ।यद्यपि, डिलिवरी तरल पदार्थहरू जस्तै जीन वाहकहरू सास लिने क्रममा प्राकृतिक रूपमा अल्भियोलीमा फैलिन्छन्, र कुनै पनि आकारका चिकित्सीय कणहरू म्यूकोसिलरी यातायातद्वारा द्रुत रूपमा हटाइन्छ।श्वासप्रश्वास पथमा जीन वाहकहरूको निवास समय विस्तार गर्नु महत्त्वपूर्ण छ तर हासिल गर्न गाह्रो छ।क्यारियर-संयुग्मित चुम्बकीय कणहरू जुन श्वसन पथको सतहमा निर्देशित गर्न सकिन्छ क्षेत्रीय लक्ष्यीकरण सुधार गर्न सक्छ।भिभो इमेजिङमा समस्याहरूको कारणले गर्दा, लागू चुम्बकीय क्षेत्रको उपस्थितिमा वायुमार्गको सतहमा त्यस्ता साना चुम्बकीय कणहरूको व्यवहार राम्रोसँग बुझिएको छैन।यस अध्ययनको उद्देश्य भिवोमा एकल र बल्क कणहरूको गतिशीलता र व्यवहारको ढाँचाहरू अध्ययन गर्न एनेस्थेटाइज्ड मुसाको श्वासनलीमा चुम्बकीय कणहरूको शृंखलाको आन्दोलनलाई भिभोमा कल्पना गर्न सिन्क्रोट्रोन इमेजिङ प्रयोग गर्नु थियो।त्यसपछि हामीले चुम्बकीय क्षेत्रको उपस्थितिमा लेन्टीभाइरल चुम्बकीय कणहरूको डेलिभरीले मुसा ट्रेकिआमा ट्रान्सडक्शनको दक्षता बढाउँछ कि भनेर पनि मूल्याङ्कन गर्‍यौं।सिन्क्रोट्रोन एक्स-रे इमेजिङले भिट्रो र भिभोमा स्थिर र गतिशील चुम्बकीय क्षेत्रहरूमा चुम्बकीय कणहरूको व्यवहार देखाउँछ।चुम्बकहरू प्रयोग गरेर जीवित वायुमार्गको सतहमा कणहरू सजिलै तान्न सकिँदैन, तर यातायातको समयमा, निक्षेपहरू दृश्यको क्षेत्रमा केन्द्रित हुन्छन्, जहाँ चुम्बकीय क्षेत्र सबैभन्दा बलियो हुन्छ।लेन्टिभाइरल चुम्बकीय कणहरू चुम्बकीय क्षेत्रको उपस्थितिमा डेलिभर गर्दा ट्रान्सडक्शन दक्षता पनि छ-गुना बढेको थियो।सँगै लिइएको, यी परिणामहरूले सुझाव दिन्छ कि लेन्टीभाइरल चुम्बकीय कणहरू र चुम्बकीय क्षेत्रहरू जीन भेक्टर लक्ष्यीकरण र भिभोमा प्रवाहकीय वायुमार्गहरूमा ट्रान्सडक्शन स्तरहरू सुधार गर्न बहुमूल्य दृष्टिकोण हुन सक्छन्।
सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) CF transmembrane conductance regulator (CFTR) भनिने एकल जीनको भिन्नताको कारणले हुन्छ।CFTR प्रोटीन एक आयन च्यानल हो जुन सिस्टिक फाइब्रोसिस को रोगजनन मा एक प्रमुख साइट, वायुमार्ग सहित सम्पूर्ण शरीर मा धेरै उपकला कोशिकाहरु मा उपस्थित छ।CFTR मा त्रुटिहरूले असामान्य पानीको यातायात, वायुमार्गको सतहको निर्जलीकरण, र वायुमार्ग सतह तरल तह (ASL) गहिराइ घटाउँछ।यसले म्यूकोसिलरी ट्राफिक (एमसीटी) प्रणालीको श्वासप्रश्वासका कणहरू र रोगजनकहरूको वायुमार्गहरू खाली गर्ने क्षमतालाई पनि असर गर्छ।हाम्रो लक्ष्य भनेको CFTR जीनको सही प्रतिलिपि प्रदान गर्न र ASL, MCT, र फोक्सोको स्वास्थ्यमा सुधार गर्न, र vivo1 मा यी प्यारामिटरहरू मापन गर्न सक्ने नयाँ प्रविधिहरू विकास गर्न जारी राख्नको लागि lentiviral (LV) जीन थेरापीको विकास गर्नु हो।
LV भेक्टरहरू सिस्टिक फाइब्रोसिस जीन थेरापीका लागि प्रमुख उम्मेद्वारहरू मध्ये एक हुन्, मुख्यतया किनभने तिनीहरूले स्थायी रूपमा वायुमार्ग बेसल सेलहरू (एयरवे स्टेम सेलहरू) मा चिकित्सीय जीन एकीकृत गर्न सक्छन्।यो महत्त्वपूर्ण छ किनभने तिनीहरूले सिस्टिक फाइब्रोसिससँग सम्बन्धित कार्यात्मक जीन-सही वायुमार्गको सतह कोशिकाहरूमा फरक पारेर सामान्य हाइड्रेशन र म्यूकस क्लियरेन्सलाई पुनर्स्थापित गर्न सक्छन्, जसको परिणामस्वरूप जीवनभर लाभहरू हुन्छन्।LV भेक्टरहरू प्रवाहकीय वायुमार्गहरू विरुद्ध निर्देशित हुनुपर्छ, किनकि CF मा फोक्सोको संलग्नता यहीँबाट सुरु हुन्छ।फोक्सोको गहिराइमा भेक्टरको डेलिभरीले अल्भियोलर ट्रान्सडक्शनको परिणाम हुन सक्छ, तर सिस्टिक फाइब्रोसिसमा यसको कुनै उपचारात्मक प्रभाव हुँदैन।यद्यपि, जीन वाहकहरू जस्ता तरल पदार्थहरू स्वाभाविक रूपमा एल्भिओलीमा सर्छन् जब बच्चा जन्माएपछि सास लिन्छ3,4 र चिकित्सकीय कणहरू MCTs द्वारा मौखिक गुफामा द्रुत रूपमा निष्कासित हुन्छन्।LV ट्रान्सडक्शनको दक्षता सेलुलर अपटेकलाई अनुमति दिन वेक्टर लक्षित कक्षहरूको नजिक रहन्छ समयको लम्बाइसँग सम्बन्धित छ - "निवास समय" 5 जुन सामान्य क्षेत्रीय वायुप्रवाहको साथसाथै बलगम र MCT कणहरूको समन्वित अपटेकद्वारा सजिलै छोटो हुन्छ।सिस्टिक फाइब्रोसिसको लागि, वायुमार्गमा LV निवास समय लम्ब्याउने क्षमता यस क्षेत्रमा उच्च स्तरको ट्रान्सडक्शन प्राप्त गर्न महत्त्वपूर्ण छ, तर अहिलेसम्म चुनौतीपूर्ण छ।
यो बाधा पार गर्न, हामी LV चुम्बकीय कण (MPs) दुई पूरक तरिकामा मद्दत गर्न सक्छ भन्ने प्रस्ताव गर्छौं।पहिले, तिनीहरूलाई लक्ष्यीकरण सुधार गर्न र जीन वाहक कणहरूलाई वायुमार्गको सही क्षेत्रमा हुन मद्दत गर्न वायुमार्गको सतहमा चुम्बकद्वारा निर्देशित गर्न सकिन्छ;र एएसएल) सेल तहमा जान्छ 6. सांसदहरू एन्टिबडीहरू, केमोथेरापी ड्रगहरू, वा अन्य साना अणुहरू जो कोष झिल्लीमा संलग्न हुन्छन् वा तिनीहरूको सम्बन्धित कोष सतह रिसेप्टरहरूमा बाँध्छन् र ट्युमर साइटहरूमा जम्मा हुन्छन् लक्षित औषधि डेलिभरी सवारी साधनको रूपमा व्यापक रूपमा प्रयोग गरिन्छ। स्थिर बिजुली को उपस्थिति।क्यान्सर थेरापीका लागि चुम्बकीय क्षेत्रहरू 7. अन्य "हाइपरथर्मिक" विधिहरू चुम्बकीय क्षेत्रहरूको सम्पर्कमा आउँदा सांसदहरूलाई तताएर ट्युमर कोशिकाहरूलाई मार्ने उद्देश्य हो।चुम्बकीय ट्रान्सफेक्सनको सिद्धान्त, जसमा चुम्बकीय क्षेत्र कोशिकाहरूमा DNA को स्थानान्तरण बढाउन ट्रान्सफेक्सन एजेन्टको रूपमा प्रयोग गरिन्छ, सामान्यतया कठिन-देखि-ट्रान्सड्युस सेल लाइनहरूको लागि गैर-भाइरल र भाइरल जीन भेक्टरहरूको दायरा प्रयोग गरेर भिट्रोमा प्रयोग गरिन्छ। ।।स्थिर चुम्बकीय क्षेत्रको उपस्थितिमा मानव ब्रोन्कियल एपिथेलियमको सेल लाइनमा भिट्रोमा LV MP को डेलिभरीको साथ LV म्याग्नेटोट्रान्सफेक्सनको दक्षता स्थापित भयो, LV भेक्टरको तुलनामा 186 गुणाले ट्रान्सडक्शनको दक्षता बढ्यो।LV MT लाई सिस्टिक फाइब्रोसिसको इन भिट्रो मोडेलमा पनि लागू गरिएको छ, जहाँ चुम्बकीय ट्रान्सफेक्सनले सिस्टिक फाइब्रोसिस स्पुटम १० को उपस्थितिमा एयर-लिक्विड इन्टरफेस कल्चरहरूमा LV ट्रान्सडक्शनलाई २० को कारकले बढाउँछ।यद्यपि, भिभो अंगमा चुम्बकीय ट्रान्सफेक्सनले अपेक्षाकृत कम ध्यान प्राप्त गरेको छ र केवल केहि जनावर अध्ययनहरूमा मूल्याङ्कन गरिएको छ 11,12,13,14,15, विशेष गरी फोक्सोमा 16,17।यद्यपि, सिस्टिक फाइब्रोसिसमा फोक्सोको उपचारमा चुम्बकीय ट्रान्सफेक्सनको सम्भावना स्पष्ट छ।Tan et al।(2020) ले भन्यो कि "चुम्बकीय न्यानो कणहरूको प्रभावकारी फुफ्फुसीय वितरणमा एक प्रमाणीकरण अध्ययनले सिस्टिक फाइब्रोसिस भएका बिरामीहरूमा क्लिनिकल परिणामहरू सुधार गर्न भविष्यको CFTR इनहेलेसन रणनीतिहरूको लागि मार्ग प्रशस्त गर्नेछ"।
लागू चुम्बकीय क्षेत्रको उपस्थितिमा श्वसन पथको सतहमा साना चुम्बकीय कणहरूको व्यवहार कल्पना गर्न र अध्ययन गर्न गाह्रो छ, र त्यसैले तिनीहरू खराब रूपमा बुझ्न सकिन्छ।अन्य अध्ययनहरूमा, हामीले ASL18 गहिराइ र MCT19 व्यवहार, 20 मा प्रत्यक्ष रूपमा ग्यास च्यानल सतह हाइड्रेशन मापन गर्न गैर-आक्रामक इमेजिङ र भिभो परिवर्तनहरूमा मिनेटको मात्राको लागि सिंक्रोट्रोन प्रोपेगेशन आधारित फेज कन्ट्रास्ट एक्स-रे इमेजिङ (PB-PCXI) विधि विकास गरेका छौं। र प्रारम्भिक सूचक उपचार प्रभावकारिताको रूपमा प्रयोग गरिन्छ।थप रूपमा, हाम्रो MCT स्कोरिङ विधिले PB-PCXI21 सँग देखिने MCT मार्करहरूको रूपमा एल्युमिना वा उच्च अपवर्तक सूचकांक गिलासबाट बनेको 10-35 µm व्यास कणहरू प्रयोग गर्दछ।दुबै विधिहरू सांसदहरू सहित कण प्रकारहरूको दायरा इमेजिङको लागि उपयुक्त छन्।
उच्च स्थानिय र अस्थायी रिजोल्युसनको कारणले गर्दा, हाम्रो PB-PCXI-आधारित ASL र MCT assess हामीलाई MP जीन वितरण विधिहरू बुझ्न र अनुकूलन गर्न मद्दत गर्न vivo मा एकल र बल्क कणहरूको गतिशीलता र व्यवहार ढाँचाहरू अध्ययन गर्न राम्रोसँग उपयुक्त छ।हामीले यहाँ प्रयोग गर्ने दृष्टिकोण SPring-8 BL20B2 बिमलाइन प्रयोग गरेर हाम्रो अध्ययनमा आधारित छ, जसमा हामीले हाम्रो विषम जीन अभिव्यक्ति ढाँचाहरू व्याख्या गर्न मद्दत गर्न मुसाको नाक र फुफ्फुसीय वायुमार्गहरूमा डमी भेक्टरको खुराक वितरण पछि तरल पदार्थको आन्दोलनको कल्पना गर्यौं। हाम्रो जीन मा।3.4 को वाहक खुराक संग पशु अध्ययन।
यस अध्ययनको उद्देश्य PB-PCXI सिन्क्रोट्रोनलाई प्रत्यक्ष मुसाको श्वासनलीमा सांसदहरूको शृङ्खलाको भिभो आन्दोलनहरूमा कल्पना गर्न प्रयोग गर्नु थियो।यी PB-PCXI इमेजिङ अध्ययनहरू MP श्रृंखला, चुम्बकीय क्षेत्र बल, र MP आन्दोलनमा तिनीहरूको प्रभाव निर्धारण गर्न स्थान परीक्षण गर्न डिजाइन गरिएको थियो।हामीले मानेका थियौं कि बाह्य चुम्बकीय क्षेत्रले डेलिभर गरिएको MF लाई रहन वा लक्षित क्षेत्रमा सार्न मद्दत गर्नेछ।यी अध्ययनहरूले हामीलाई चुम्बक कन्फिगरेसनहरू निर्धारण गर्न अनुमति दियो जसले भण्डारण पछि श्वासनलीमा बाँकी कणहरूको मात्रालाई अधिकतम बनाउँछ।अध्ययनको दोस्रो शृङ्खलामा, हामीले यो इष्टतम कन्फिगरेसन प्रयोग गर्ने उद्देश्य राखेका थियौं जुन ट्रान्सडक्सन ढाँचा प्रदर्शन गर्नको लागि LV-MPs को vivo डेलिभरीको परिणामस्वरूप मुसा एयरवेजमा, यो धारणामा कि LV-MPs को डेलिभरी एयरवे लक्ष्यीकरणको सन्दर्भमा परिणाम हुनेछ। बढेको LV ट्रान्सडक्शन दक्षतामा।।
सबै पशु अध्ययनहरू एडिलेड विश्वविद्यालय (M-2019-060 र M-2020-022) र SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee द्वारा अनुमोदित प्रोटोकलहरू अनुसार सञ्चालन गरिएको थियो।प्रयोगहरू ARRIVE को सिफारिसहरू अनुसार गरिएको थियो।
सबै एक्स-रे तस्बिरहरू BL20XU बिमलाइनमा जापानको SPring-8 सिन्क्रोट्रोनमा 21,22 अघि वर्णन गरिएको जस्तै सेटअप प्रयोग गरेर लिइयो।संक्षेपमा, प्रयोगात्मक बक्स सिन्क्रोट्रोन भण्डारण रिंगबाट 245 मिटरमा अवस्थित थियो।०.६ मिटरको नमूना देखि डिटेक्टर दूरी कण इमेजिङ अध्ययनका लागि र ०.३ मिटर भिभो इमेजिङ अध्ययनका लागि चरण कन्ट्रास्ट प्रभावहरू सिर्जना गर्न प्रयोग गरिन्छ।२५ केभी ऊर्जा भएको मोनोक्रोमेटिक बीम प्रयोग गरिएको थियो।छविहरू उच्च रिजोल्युसन एक्स-रे ट्रान्सड्यूसर (SPring-8 BM3) को sCMOS डिटेक्टरमा जोडिएको प्रयोग गरेर अधिग्रहण गरिएको थियो।ट्रान्सड्यूसरले 10 µm बाक्लो सिन्टिलेटर (Gd3Al2Ga3O12) को प्रयोग गरी एक्स-रेहरूलाई दृश्य प्रकाशमा रूपान्तरण गर्छ, जुन त्यसपछि ×10 (NA 0.3) माइक्रोस्कोप उद्देश्य प्रयोग गरेर sCMOS सेन्सरमा निर्देशित गरिन्छ।sCMOS डिटेक्टर Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) थियो जसको एरे साइज 2048 × 2048 पिक्सेल र 6.5 × 6.5 µm को कच्चा पिक्सेल साइज थियो।यो सेटिङले ०.५१ µm को प्रभावकारी आइसोट्रोपिक पिक्सेल आकार र लगभग १.१ मिमी × १.१ मिमीको दृश्य क्षेत्र दिन्छ।100 ms को एक्सपोजर अवधि वायुमार्ग भित्र र बाहिर चुम्बकीय कणहरूको सिग्नल-टु-आवाज अनुपात अधिकतम गर्नको लागि छनोट गरिएको थियो जबकि श्वासप्रश्वासको कारणले हुने गति कलाकृतिहरूलाई कम गर्दै।भिभो अध्ययनहरूको लागि, एक्स-रे बिमलाई एक्सपोजरहरू बीचमा रोकेर विकिरण खुराक सीमित गर्न एक्स-रे मार्गमा द्रुत एक्स-रे शटर राखिएको थियो।
LV मिडिया कुनै पनि SPring-8 PB-PCXI इमेजिङ अध्ययनहरूमा प्रयोग गरिएन किनभने BL20XU इमेजिङ च्याम्बर बायोसेफ्टी लेभल 2 प्रमाणित छैन।यसको सट्टा, हामीले आकार, सामग्री, फलामको सांद्रता, र अनुप्रयोगहरूको दायरा कभर गर्ने दुई व्यावसायिक विक्रेताहरूबाट राम्ररी चरित्र भएका सांसदहरूको दायरा चयन गर्यौं - पहिले चुम्बकीय क्षेत्रहरूले गिलास केशिकाहरूमा सांसदहरूको आन्दोलनलाई कसरी असर गर्छ भनेर बुझ्नको लागि, र त्यसपछि। जीवित वायुमार्गहरू।सतह।MP को आकार 0.25 देखि 18 µm सम्म भिन्न हुन्छ र विभिन्न सामग्रीबाट बनेको हुन्छ (तालिका 1 हेर्नुहोस्), तर MP मा चुम्बकीय कणहरूको आकार सहित प्रत्येक नमूनाको संरचना अज्ञात छ।हाम्रो व्यापक MCT अध्ययन 19, 20, 21, 23, 24 को आधारमा, हामी आशा गर्छौं कि MP 5 µm तल श्वासनली वायुमार्ग सतहमा देख्न सकिन्छ, उदाहरणका लागि, MP आन्दोलनको सुधारिएको दृश्यता हेर्न लगातार फ्रेमहरू घटाएर।0.25 µm को एकल MP इमेजिङ उपकरणको रिजोल्युसन भन्दा सानो छ, तर PB-PCXI ले तिनीहरूको भोल्युमेट्रिक कन्ट्रास्ट र सतह तरलको आन्दोलन पत्ता लगाउने अपेक्षा गरिएको छ जसमा तिनीहरू जम्मा गरिएपछि जम्मा हुन्छन्।
तालिकामा प्रत्येक सांसदको लागि नमूनाहरू।1 0.63 मिमी को आन्तरिक व्यास संग 20 μl गिलास केशिकाहरू (Drummond Microcaps, PA, USA) मा तयार गरिएको थियो।कर्पस्कुलर कणहरू पानीमा उपलब्ध छन्, जबकि CombiMag कणहरू निर्माताको स्वामित्वको तरलमा उपलब्ध छन्।प्रत्येक ट्यूब आधा तरल (लगभग 11 μl) भरिएको छ र नमूना होल्डरमा राखिएको छ (चित्र 1 हेर्नुहोस्)।गिलास केशिकाहरू क्रमशः इमेजिङ चेम्बरमा स्टेजमा तेर्सो रूपमा राखिएको थियो, र तरलको किनारमा राखिएको थियो।दुर्लभ पृथ्वी, नियोडिमियम, फलाम र बोरन (NdFeB) (N35, cat. no. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) बाट बनेको 19 mm व्यास (28 mm लामो) निकेल-शेल चुम्बक 1.17 T को रिमेनन्ससँग जोडिएको थियो। प्राप्त गर्नको लागि अलग स्थानान्तरण तालिका टाढाबाट रेन्डरिङ समयमा आफ्नो स्थिति परिवर्तन।एक्स-रे इमेजिङ सुरु हुन्छ जब चुम्बक नमूना भन्दा लगभग 30 मिमी माथि राखिएको हुन्छ र छविहरू प्रति सेकेन्ड 4 फ्रेममा प्राप्त गरिन्छ।इमेजिङको क्रममा, चुम्बकलाई गिलास केशिका ट्यूबको नजिक ल्याइएको थियो (लगभग 1 मिमीको दूरीमा) र त्यसपछि क्षेत्र बल र स्थितिको प्रभाव मूल्याङ्कन गर्न ट्यूबसँगै सारियो।
xy नमूनाको अनुवादको चरणमा गिलास केशिकाहरूमा MP नमूनाहरू समावेश गर्ने इन भिट्रो इमेजिङ सेटअप।एक्स-रे बीमको बाटो रातो डटेड रेखाले चिन्ह लगाइएको छ।
एक पटक सांसदहरूको इन भिट्रो दृश्यता स्थापित भएपछि, तिनीहरूको एक उपसमूहलाई जंगली-प्रकारका महिला विस्टार अल्बिनो मुसा (~ 12 हप्ता पुरानो, ~ 200 ग्राम) मा vivo मा परीक्षण गरियो।Medetomidine 0.24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japan), midazolam 3.2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) र butorphanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika)।इन्ट्रापेरिटोनियल इन्जेक्सनद्वारा मुसालाई फार्मा (जापान) मिश्रणले एनेस्थेटाइज गरिएको थियो।एनेस्थेसिया पछि, उनीहरूलाई श्वासनलीको वरिपरिको फर हटाएर, इन्डोट्र्याकियल ट्यूब (ET; 16 Ga इंट्राभेनस क्यान्युला, टेरुमो बीसीटी) सम्मिलित गरेर, र थर्मल झोला भएको कस्टम-मेड इमेजिङ प्लेटमा सुपिन पोजिसनमा स्थिर गरेर इमेजिङको लागि तयार गरिएको थियो। शरीरको तापमान कायम राख्न।22. चित्र 2a मा देखाइए अनुसार एक्स-रे छविमा श्वासनलीलाई तेर्सो रूपमा पङ्क्तिबद्ध गर्नको लागि इमेजिङ प्लेटलाई इमेजिङ बाकसमा नमूना चरणमा थोरै कोणमा जोडिएको थियो।
(a) SPring-8 इमेजिङ एकाइमा भिभो इमेजिङ सेटअपमा, रातो डटेड लाइनले चिन्ह लगाइएको एक्स-रे बीम पथ।(b,c) Tracheal चुम्बक स्थानीयकरण दुई orthogonally माउन्ट आईपी क्यामेरा प्रयोग गरेर टाढाबाट प्रदर्शन गरिएको थियो।स्क्रिनमा छविको बायाँ छेउमा, तपाईंले टाउको समातेको तार लुप र ET ट्यूब भित्र स्थापना गरिएको डेलिभरी क्यानुला देख्न सक्नुहुन्छ।
100 μl गिलास सिरिन्ज प्रयोग गरेर रिमोट कन्ट्रोल सिरिन्ज पम्प प्रणाली (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) PE10 ट्युबिङ (0.61 mm OD, 0.28 mm ID) मा 30 Ga सुई प्रयोग गरेर जडान गरिएको थियो।इन्डोट्राचियल ट्यूब घुसाउँदा टिप ट्रेकिआमा सही स्थितिमा छ भनी सुनिश्चित गर्न ट्यूबलाई चिन्ह लगाउनुहोस्।माइक्रोपम्प प्रयोग गरेर, सिरिन्ज प्लन्जर हटाइयो र ट्यूबको टिपलाई MP नमूनामा डुबाइयो।लोड गरिएको डेलिभरी ट्यूबलाई हाम्रो अपेक्षित लागू चुम्बकीय क्षेत्रको सबैभन्दा बलियो भागमा टिप राखेर, एन्डोट्राचियल ट्यूबमा सम्मिलित गरियो।छवि अधिग्रहण हाम्रो Arduino-आधारित टाइमिङ बक्समा जडान गरिएको ब्रस डिटेक्टर प्रयोग गरेर नियन्त्रण गरिएको थियो, र सबै संकेतहरू (जस्तै, तापमान, श्वासप्रश्वास, शटर खुला/बन्द, र छवि अधिग्रहण) Powerlab र LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) प्रयोग गरेर रेकर्ड गरिएको थियो। 22 जब इमेजिङ जब आवास अनुपलब्ध थियो, दुई आईपी क्यामेराहरू (Panasonic BB-SC382) एक अर्कामा लगभग 90° मा राखिएको थियो र इमेजिङको क्रममा श्वासनलिका सापेक्ष चुम्बकको स्थिति नियन्त्रण गर्न प्रयोग गरियो (चित्र 2b, c)।गति कलाकृतिहरू कम गर्नको लागि, टर्मिनल श्वसन प्रवाह पठारको समयमा प्रति सास एक छवि प्राप्त गरिएको थियो।
चुम्बक दोस्रो चरणमा जोडिएको छ, जुन इमेजिङ शरीरको बाहिरी भागमा टाढाबाट अवस्थित हुन सक्छ।चुम्बकको विभिन्न स्थान र कन्फिगरेसनहरू परीक्षण गरियो, जसमा: ट्रेकिआ माथि लगभग 30° को कोणमा राखिएको थियो (कन्फिगरेसनहरू चित्र 2a र 3a मा देखाइएको छ);एउटा चुम्बक जनावरको माथि र अर्को तल, ध्रुवहरूसँग आकर्षणको लागि सेट गरिएको छ (चित्र 3b)।, जनावरको माथि एउटा चुम्बक र अर्को तल, प्रतिकर्षणको लागि ध्रुवहरू (चित्र 3c), र एउटा चुम्बक माथि र श्वासनलीमा सीधा (चित्र 3d)।जनावर र चुम्बक सेटअप गरेपछि र सिरिन्ज पम्पमा परीक्षण अन्तर्गत MP लोड गरिसकेपछि, छविहरूको अधिग्रहणमा 4 μl/सेकेन्डको दरमा 50 μl को खुराक डेलिभर गर्नुहोस्।चुम्बक त्यसपछि छविहरू प्राप्त गर्न जारी राख्दा श्वासनलीको साथ वा माथि पछाडि सारिन्छ।
भिभो इमेजिङका लागि चुम्बक कन्फिगरेसन (a) श्वासनली माथि लगभग 30° को कोणमा एउटा चुम्बक, (b) आकर्षणको लागि कन्फिगर गरिएका दुई चुम्बकहरू, (c) प्रतिकर्षणका लागि कन्फिगर गरिएका दुई चुम्बकहरू, (d) एउटा चुम्बक माथि र लम्बाइमा श्वासनली।पर्यवेक्षकले मुखबाट श्वासनली हुँदै फोक्सोसम्म हेरे र एक्स-रे किरण मुसाको देब्रे छेउ हुँदै दाहिने तर्फबाट निस्क्यो।चुम्बक या त श्वासनलीको लम्बाइमा सारिएको छ वा एक्स-रे किरणको दिशामा श्वासनलीको माथि बायाँ र दायाँ।
हामीले श्वासप्रश्वास र मुटुको गतिको मिश्रणको अभावमा वायुमार्गमा कणहरूको दृश्यता र व्यवहार निर्धारण गर्न पनि खोज्यौं।तसर्थ, इमेजिङ अवधिको अन्त्यमा, पेन्टोबार्बिटल ओभरडोज (सोम्नोपेन्टाइल, पिटम्यान-मूर, वाशिंगटन क्रसिङ, संयुक्त राज्य अमेरिका; ~ 65 मिलीग्राम / किग्रा आईपी) को कारण जनावरहरूलाई मानवीय रूपमा ईथनाइज गरिएको थियो।केही जनावरहरूलाई इमेजिङ प्लेटफर्ममा छोडियो, र सास फेर्न र मुटुको धड्कन बन्द भएपछि, इमेजिङ प्रक्रिया दोहोर्याइएको थियो, यदि कुनै सांसद वायुमार्गको सतहमा देखिएन भने MP को अतिरिक्त खुराक थपियो।
नतिजा तस्बिरहरू फ्ल्याट र अँध्यारो क्षेत्रको लागि सच्याइयो र त्यसपछि MATLAB (R2020a, The Mathworks) मा लेखिएको अनुकूलन स्क्रिप्ट प्रयोग गरेर चलचित्र (20 फ्रेम प्रति सेकेन्ड; 15-25 × सामान्य गति श्वासप्रश्वास दरमा निर्भर गर्दछ) मा भेला गरियो।
LV जीन भेक्टर डेलिभरीमा सबै अध्ययनहरू एडिलेड प्रयोगशाला पशु अनुसन्धान केन्द्र विश्वविद्यालयमा सञ्चालन गरिएको थियो र चुम्बकीय क्षेत्रको उपस्थितिमा LV-MP डेलिभरीले vivo मा जीन स्थानान्तरण बढाउन सक्छ कि भनेर मूल्याङ्कन गर्न SPring-8 प्रयोगको नतिजाहरू प्रयोग गर्ने लक्ष्य राखिएको थियो। ।MF र चुम्बकीय क्षेत्रको प्रभावहरूको मूल्याङ्कन गर्न, जनावरहरूको दुई समूहलाई उपचार गरिएको थियो: एउटा समूहलाई चुम्बक प्लेसमेन्टको साथ LV MF सँग इन्जेक्सन गरिएको थियो, र अर्को समूहलाई चुम्बक बिना LV MF सँग नियन्त्रण समूहको साथ इंजेक्शन गरिएको थियो।
LV जीन भेक्टरहरू पहिले वर्णन गरिएका विधिहरू 25, 26 प्रयोग गरेर उत्पन्न गरिएको छ।LacZ भेक्टरले MPSV संवैधानिक प्रमोटर (LV-LacZ) द्वारा संचालित एक आणविक स्थानीयकृत बिटा-ग्यालेक्टोसिडेज जीन व्यक्त गर्दछ, जसले ट्रान्सड्युस गरिएको कोशिकाहरूमा नीलो प्रतिक्रिया उत्पादन गर्दछ, फोक्सोको तन्तुको अगाडि र भागहरूमा देखिने।TU/ml मा titer गणना गर्न hemocytometer को प्रयोग गरेर LacZ-positive कोशिकाहरूको संख्या म्यानुअल रूपमा गणना गरेर सेल संस्कृतिहरूमा टाइट्रेसन गरिएको थियो।वाहकहरूलाई -80°C मा क्रायोप्रिजर्व गरिएको छ, प्रयोग गर्नु अघि पगालिएको छ, र 1:1 मिलाएर CombiMag मा बाँधिएको छ र डेलिभरी अघि कम्तिमा 30 मिनेटको लागि बरफमा इन्क्युबेटेड छ।
सामान्य Sprague Dawley मुसा (n = 3/समूह, 0.4mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) र 60mg/kg ketamine (Ilium, Australia) को मिश्रणको साथ ~2-3 एनेस्थेटाइज्ड ip 1 महिनाको उमेरमा) ip 16 Ga इंट्राभेनस क्यानुलाको साथ इंजेक्शन र गैर-सर्जिकल मौखिक क्यानुलेसन।श्वासनली वायुमार्गको तन्तुले LV ट्रान्सडक्शन प्राप्त गर्छ भन्ने कुरा सुनिश्चित गर्न, यो हाम्रो पहिले वर्णन गरिएको मेकानिकल पटरबेशन प्रोटोकल प्रयोग गरी कन्डिसन गरिएको थियो जसमा ट्रेचियल वायुमार्गको सतहलाई तारको टोकरी (N-Circle, nitinol stone extractor without tip NTSE-022115 ) -UDH। कुक मेडिकल, संयुक्त राज्य अमेरिका) 30 p28।त्यसपछि, बायोसेफ्टी क्याबिनेटमा गडबडी भएको लगभग 10 मिनेट पछि, LV-MP को ट्रेकियल प्रशासन प्रदर्शन गरियो।
यस प्रयोगमा प्रयोग गरिएको चुम्बकीय क्षेत्रलाई भिभो एक्स-रे अध्ययनमा समान रूपमा कन्फिगर गरिएको थियो, उही चुम्बकहरू श्वासनलीमा डिस्टिलेसन स्टेन्ट क्ल्याम्पहरू (चित्र 4) संग राखिएको थियो।LV-MP को 50 μl भोल्युम (2 x 25 μl aliquots) लाई पहिले वर्णन गरिए अनुसार जेल-टिप्ड पिपेट प्रयोग गरेर ट्रेकिआ (n = 3 जनावरहरू) मा डेलिभर गरियो।नियन्त्रण समूह (n = 3 जनावरहरू) ले चुम्बकको प्रयोग बिना नै समान LV-MP प्राप्त गर्यो।इन्फ्युजन पूरा भएपछि, क्यान्युलालाई एन्डोट्राकियल ट्यूबबाट हटाइन्छ र जनावरलाई बाहिर निकालिन्छ।चुम्बक हटाउनु अघि 10 मिनेटको लागि ठाउँमा रहन्छ।मुसालाई मेलोक्सिकम (१ एमएल/केजी) (इलियम, अष्ट्रेलिया) को साथ छालाको तलामा डोज गरिएको थियो र त्यसपछि 1 मिलीग्राम / किलोग्राम एटिपामाजोल हाइड्रोक्लोराइड (एन्टिसेडन, जोएटिस, अष्ट्रेलिया) को इन्ट्रापेरिटोनियल इंजेक्शनद्वारा एनेस्थेसिया निकालियो।एनेस्थेसियाबाट पूर्ण रिकभरी नभएसम्म मुसालाई न्यानो राखियो र अवलोकन गरियो।
जैविक सुरक्षा क्याबिनेटमा LV-MP डेलिभरी उपकरण।तपाईले देख्न सक्नुहुन्छ कि ET ट्यूबको हल्का खैरो लुयर-लक स्लिभ मुखबाट बाहिर निस्कन्छ, र चित्रमा देखाइएको जेल पिपेट टिप ET ट्यूब मार्फत श्वासनलीमा इच्छित गहिराइमा घुसाइएको छ।
LV-MP प्रशासन प्रक्रियाको एक हप्ता पछि, जनावरहरूलाई 100% CO2 को इनहेलेसनद्वारा मानवीय रूपमा बलिदान गरियो र हाम्रो मानक X-gal उपचार प्रयोग गरेर LacZ अभिव्यक्तिको मूल्याङ्कन गरियो।एन्डोट्राकियल ट्यूब प्लेसमेन्टको कारणले कुनै पनि मेकानिकल क्षति वा तरल पदार्थ अवधारणलाई विश्लेषणमा समावेश गरिने छैन भनेर सुनिश्चित गर्न तीनवटा सबैभन्दा काउडल कार्टिलेज रिंगहरू हटाइयो।विश्लेषणको लागि दुई भागहरू प्राप्त गर्न प्रत्येक श्वासनलीलाई लम्बाइमा काटिएको थियो र ल्युमिनल सतहको कल्पना गर्न Minutien सुई (फाइन साइंस टूल्स) प्रयोग गरेर सिलिकॉन रबर (Sylgard, Dow Inc) भएको कपमा राखिएको थियो।डिजिलाइट क्यामेरा र TCapture सफ्टवेयर (Tucsen Photonics, China) को साथ Nikon माइक्रोस्कोप (SMZ1500) को प्रयोग गरेर ट्रान्सड्यूस गरिएका सेलहरूको वितरण र चरित्र फ्रन्टल फोटोग्राफीद्वारा पुष्टि गरियो।छविहरू 20x म्याग्निफिकेसन (श्वासनलीको पूर्ण चौडाइको लागि अधिकतम सेटिङ सहित) मा प्राप्त गरियो, श्वासनलीको सम्पूर्ण लम्बाइ चरण-दर-चरण प्रदर्शन गरिएको छ, प्रत्येक छविको बीचमा पर्याप्त ओभरल्याप प्रदान गर्दै छविहरूलाई "सिलाई" अनुमति दिन।प्रत्येक श्वासनलीका तस्बिरहरूलाई कम्पोजिट छवि सम्पादक संस्करण २.०.३ (माइक्रोसफ्ट रिसर्च) प्रयोग गरेर प्लानर मोशन एल्गोरिथ्म प्रयोग गरेर एकल कम्पोजिट छविमा मिलाइयो। 0.35 < ह्यु < 0.58, संतृप्ति > 0.15, र मान < 0.7 को सेटिङहरू प्रयोग गरेर, पहिले वर्णन गरिए अनुसार प्रत्येक जनावरबाट ट्रेकियल कम्पोजिट छविहरू भित्र LacZ अभिव्यक्तिको क्षेत्रलाई स्वचालित MATLAB स्क्रिप्ट (R2020a, MathWorks) प्रयोग गरी परिमाण गरिएको थियो। 0.35 < ह्यु < 0.58, संतृप्ति > 0.15, र मान < 0.7 को सेटिङहरू प्रयोग गरेर, पहिले वर्णन गरिए अनुसार प्रत्येक जनावरबाट ट्रेचियल कम्पोजिट छविहरू भित्र LacZ अभिव्यक्तिको क्षेत्रलाई स्वचालित MATLAB स्क्रिप्ट (R2020a, MathWorks) प्रयोग गरी परिमाण गरिएको थियो। Площадь экспрессии LacZ нария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек ०,३५ <оттенок <0,58, насыщенность> ०,१५ <зениченность ,७। प्रत्येक जनावरबाट कम्पोजिट ट्रेकियल छविहरूमा LacZ अभिव्यक्तिको क्षेत्रलाई स्वचालित MATLAB स्क्रिप्ट (R2020a, MathWorks) को प्रयोग गरेर मापन गरिएको थियो जुन पहिले वर्णन गरिएको थियो 28 0.35 को सेटिङहरू प्रयोग गरेर।०.१५ र मान<०.७।如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复合图像茟臡御合图像茟中化，使用0.35 < 色调< 0.58、饱和度> 0.15 和值< 0.7 的设置।如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 的复又 茾又使用 使用 使用 ०.३५ <色调 <०.५८ 、> ०.१५ 和值 <०.७ 的。 .. ....... ....... हिप Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованиеция R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 । ०.३५ < ह्यु < ०.५८, संतृप्ति > ०.१५ र मान < ०.७ को सेटिङहरू प्रयोग गरेर वर्णन गरिए अनुसार प्रत्येक जनावरको श्वासनलीको समग्र छविहरूमा LacZ अभिव्यक्तिको क्षेत्रहरू स्वचालित MATLAB स्क्रिप्ट (R2020a, MathWorks) को प्रयोग गरेर परिमाण गरिएको थियो।GIMP v2.10.24 मा टिस्यु कन्टुरहरू ट्र्याक गरेर, टिस्यु क्षेत्र पहिचान गर्न र ट्रेकियल टिस्यु बाहिर कुनै पनि गलत पत्ता लगाउन रोक्नको लागि प्रत्येक मिश्रित छविको लागि म्यानुअल रूपमा मास्क सिर्जना गरिएको थियो।प्रत्येक जनावरका सबै मिश्रित छविहरूबाट दाग भएका क्षेत्रहरूलाई त्यो जनावरको लागि कुल दाग क्षेत्र दिनको लागि संक्षेप गरिएको थियो।पेन्ट गरिएको क्षेत्रलाई मास्कको कुल क्षेत्रफलले सामान्यीकृत क्षेत्र प्राप्त गर्न विभाजन गरिएको थियो।
प्रत्येक ट्रेकिआ प्याराफिनमा इम्बेड गरिएको थियो र 5 µm बाक्लो सेक्शन गरिएको थियो।खण्डहरूलाई 5 मिनेटको लागि तटस्थ द्रुत रातोसँग काउन्टरस्टेन गरिएको थियो र Nikon Eclipse E400 माइक्रोस्कोप, DS-Fi3 क्यामेरा र NIS एलिमेन्ट क्याप्चर सफ्टवेयर (संस्करण 5.20.00) प्रयोग गरेर छविहरू प्राप्त गरियो।
सबै सांख्यिकीय विश्लेषणहरू GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) मा प्रदर्शन गरिएको थियो।सांख्यिकीय महत्व p ≤ ०.०५ मा सेट गरिएको थियो।Shapiro-Wilk परीक्षण प्रयोग गरेर सामान्यता परीक्षण गरिएको थियो र LacZ स्टेनिङ्मा भिन्नताहरू एक unpaired t-परीक्षण प्रयोग गरेर मूल्याङ्कन गरिएको थियो।
तालिका 1 मा वर्णन गरिएका छ जना सांसदहरूलाई PCXI द्वारा जाँच गरिएको थियो, र दृश्यता तालिका 2 मा वर्णन गरिएको छ। PCXI द्वारा दुई पोलिस्टाइरिन सांसदहरू (MP1 र MP2; क्रमशः 18 µm र 0.25 µm) देखिएनन्, तर बाँकी नमूनाहरू पहिचान गर्न सकिन्छ। (उदाहरणहरू चित्र 5 मा देखाइएको छ)।MP3 र MP4 कमजोर रूपमा देखिने छन् (10-15% Fe3O4; 0.25 µm र 0.9 µm, क्रमशः)।यद्यपि MP5 (98% Fe3O4; 0.25 µm) मा परीक्षण गरिएका केही साना कणहरू समावेश थिए, यो सबैभन्दा स्पष्ट थियो।CombiMag MP6 उत्पादन छुट्याउन गाह्रो छ।सबै अवस्थामा, MFs पत्ता लगाउने हाम्रो क्षमतामा चुम्बकलाई केशिकाको समानान्तर अगाडि र पछाडि सारेर धेरै सुधार गरिएको थियो।चुम्बकहरू केशिकाबाट टाढा जाँदा, कणहरूलाई लामो चेनहरूमा तानियो, तर चुम्बकहरू नजिक आयो र चुम्बकीय क्षेत्रको बल बढ्दै जाँदा, कणहरू केशिकाको माथिल्लो सतहतिर सर्दै गर्दा कणहरूको चेनहरू छोटो हुँदै गयो (पूरक भिडियो S1 हेर्नुहोस्। : MP4), सतहमा कण घनत्व बढ्दै।यसको विपरित, जब केशिकाबाट चुम्बक हटाइन्छ, फिल्ड बल घट्छ र MPs केशिकाको माथिल्लो सतहबाट विस्तारित लामो चेनहरूमा पुन: व्यवस्थित हुन्छन् (पूरक भिडियो S2: MP4 हेर्नुहोस्)।चुम्बक चल्न बन्द भएपछि, कणहरू सन्तुलन स्थितिमा पुगेपछि केही समयको लागि चलिरहन्छन्।केशिकाको माथिल्लो सतहबाट MP तिर र टाढा जाँदा, चुम्बकीय कणहरूले तरल पदार्थको माध्यमबाट मलबे तान्न्छन्।
PCXI अन्तर्गत MP को दृश्यता नमूनाहरू बीच धेरै फरक हुन्छ।(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 र (d) MP6।यहाँ देखाइएका सबै तस्बिरहरू केशिका माथि लगभग 10 मिमी स्थित चुम्बकको साथ लिइएको थियो।स्पष्ट ठूला सर्कलहरू केशिकाहरूमा फसेका हावाका बुलबुलेहरू हुन्, स्पष्ट रूपमा फेज कन्ट्रास्ट छविको कालो र सेतो किनारा सुविधाहरू देखाउँदै।रातो बाकसले कन्ट्रास्ट बढाउने म्याग्निफिकेसनलाई संकेत गर्छ।ध्यान दिनुहोस् कि सबै आंकडाहरूमा चुम्बक सर्किटहरूको व्यास मापन गर्न मिल्दैन र देखाइएको भन्दा लगभग 100 गुणा ठूलो छ।
चुम्बक केशिकाको शीर्षमा बायाँ र दायाँ सर्ने क्रममा, MP स्ट्रिङको कोण चुम्बकसँग पङ्क्तिबद्ध हुन परिवर्तन हुन्छ (चित्र 6 हेर्नुहोस्), यसरी चुम्बकीय क्षेत्र रेखाहरू चित्रण गर्दै।MP3-5 को लागि, कर्ड थ्रेसहोल्ड कोणमा पुगेपछि, कणहरू केशिकाको माथिल्लो सतहमा तान्छन्।यसले प्रायः सांसदहरूलाई चुम्बकीय क्षेत्र सबैभन्दा बलियो भएको ठाउँमा ठूला समूहहरूमा क्लस्टर हुन्छ (पूरक भिडियो S3: MP5 हेर्नुहोस्)।यो विशेष गरी केशिकाको अन्त्यको नजिक इमेजिङ गर्दा पनि स्पष्ट हुन्छ, जसले MP लाई तरल-एयर इन्टरफेसमा जम्मा र ध्यान केन्द्रित गर्दछ।MP6 मा कणहरू, जुन MP3-5 मा भन्दा भेद गर्न गाह्रो थियो, चुम्बक केशिका छेउमा सर्दा तानिएन, तर MP स्ट्रिङहरू अलग भए, कणहरूलाई दृश्यमा छोडेर (पूरक भिडियो S4: MP6 हेर्नुहोस्)।केही अवस्थामा, जब चुम्बकलाई इमेजिङ साइटबाट लामो दूरीमा सार्दै लागू चुम्बकीय क्षेत्र घटाइयो, कुनै पनि बाँकी सांसदहरू बिस्तारै गुरुत्वाकर्षणद्वारा ट्यूबको तल्लो सतहमा झर्छन्, स्ट्रिङमा रहन्छन् (पूरक भिडियो S5: MP3 हेर्नुहोस्)। ।
MP स्ट्रिङको कोण परिवर्तन हुन्छ जब चुम्बक केशिका माथि दायाँतिर सर्छ।(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 र (d) MP6।रातो बाकसले कन्ट्रास्ट बढाउने म्याग्निफिकेसनलाई संकेत गर्छ।कृपया ध्यान दिनुहोस् कि अतिरिक्त भिडियोहरू सूचनामूलक उद्देश्यका लागि हुन् किनभने तिनीहरूले महत्त्वपूर्ण कण संरचना र गतिशील जानकारी प्रकट गर्दछ जुन यी स्थिर छविहरूमा कल्पना गर्न सकिँदैन।
हाम्रो परीक्षणहरूले देखाएको छ कि चुम्बकलाई श्वासनलीमा बिस्तारै अगाडि र पछाडि सार्दा vivo मा जटिल आन्दोलनको सन्दर्भमा MF को दृश्यावलोकन गर्न सजिलो हुन्छ।केशिकामा polystyrene मोती (MP1 र MP2) देखिएन किनभने भिभोमा कुनै पनि परीक्षणहरू गरिएन।बाँकी चार MF हरू मध्ये प्रत्येकलाई श्वासनलीमा राखिएको चुम्बकको लामो अक्षसँग ठाडोमा 30° को कोणमा राखिएको थियो (चित्र 2b र 3a हेर्नुहोस्), किनकि यसले लामो MF चेनहरू बनाएको थियो र अझ प्रभावकारी थियो। चुम्बक भन्दा।।कन्फिगरेसन समाप्त भयो।MP3, MP4 र MP6 कुनै पनि जीवित जनावरको श्वासनलीमा फेला परेको छैन।मानवीय रूपमा जनावरहरूलाई मारेपछि मुसाको श्वासप्रश्वास मार्गको दृश्य हेर्दा, सिरिन्ज पम्प प्रयोग गरेर थप मात्रा थप्दा पनि कणहरू अदृश्य रहन्छन्।MP5 मा उच्चतम फलामको अक्साइड सामग्री थियो र एक मात्र दृश्यात्मक कण थियो, त्यसैले यो vivo मा MP व्यवहार मूल्याङ्कन गर्न र विशेषता गर्न प्रयोग गरिएको थियो।
MF सम्मिलनको समयमा श्वासनलीमा चुम्बकको स्थानान्तरणले धेरै MF हरू दृश्यको क्षेत्रमा केन्द्रित भए, तर सबै होइन।कणहरूको ट्रेकियल प्रविष्टि मानवीय रूपमा euthanized जनावरहरूमा राम्रोसँग अवलोकन गरिन्छ।चित्र 7 र पूरक भिडियो S6: MP5 ले भेन्ट्रल ट्रेकिआको सतहमा कणहरूको द्रुत चुम्बकीय क्याप्चर र पङ्क्तिबद्धता देखाउँदछ, यसले संकेत गर्दछ कि सांसदहरूलाई ट्रेकिआको इच्छित क्षेत्रहरूमा लक्षित गर्न सकिन्छ।MF डिलिवरी पछि श्वासनलीको छेउमा धेरै टाढा खोज्दा, केहि MFs क्यारिनाको नजिक फेला पर्यो, जसले सबै MF हरू जम्मा गर्न र समात्न अपर्याप्त चुम्बकीय क्षेत्र शक्तिलाई संकेत गर्दछ, किनकि तिनीहरू तरल पदार्थ व्यवस्थापनको क्रममा अधिकतम चुम्बकीय क्षेत्र शक्तिको क्षेत्र मार्फत डेलिभर गरिएको थियो।प्रक्रिया।यद्यपि, प्रसवोत्तर MP सांद्रता छवि क्षेत्र वरिपरि उच्च थियो, सुझाव दिन्छ कि धेरै सांसदहरू वायुमार्ग क्षेत्रहरूमा रहे जहाँ लागू चुम्बकीय क्षेत्र बल उच्चतम थियो।
इमेजिङ क्षेत्रको ठीक माथि राखिएको चुम्बकको साथ हालसालै euthanized मुसाको श्वासनलीमा MP5 को डेलिभरी अघि र (b) को छविहरू।चित्रित क्षेत्र दुई कार्टिलागिनस रिंगहरू बीच अवस्थित छ।सांसद डेलिभर हुनु अघि वायुमार्गमा केही तरल पदार्थ छ।रातो बाकसले कन्ट्रास्ट बढाउने म्याग्निफिकेसनलाई संकेत गर्छ।यी तस्बिरहरू S6: MP5 सप्लिमेन्टरी भिडियोमा चित्रित भिडियोबाट लिइएका हुन्।
भिभोमा श्वासनलीको साथमा चुम्बक सार्दा वायुमार्गको सतहमा MP चेनको कोणमा परिवर्तन भयो, केशिकाहरूमा देखाइएको जस्तै (चित्र 8 र पूरक भिडियो S7: MP5 हेर्नुहोस्)।यद्यपि, हाम्रो अध्ययनमा, सांसदहरूलाई जीवित श्वासप्रश्वास पथको सतहमा तान्न सकिँदैन, जस्तै केशिकाहरूले गर्न सक्छन्।कतिपय अवस्थामा, चुम्बक बायाँ र दायाँ सर्दा MP चेन लामो हुन्छ।चाखलाग्दो कुरा के छ भने, हामीले यो पनि फेला पार्‍यौं कि कण श्रृंखलाले तरल पदार्थको सतह तहको गहिराईलाई परिवर्तन गर्छ जब चुम्बकलाई श्वासनलीमा लम्बाइमा सारिन्छ, र चुम्बकलाई सीधै माथि सार्दा विस्तार हुन्छ र कण चेन ठाडो स्थितिमा घुमाइन्छ (हेर्नुहोस्। पूरक भिडियो S7)।: MP5 मा ०:०९, तल दायाँ)।चुम्बकलाई श्वासनलीको माथिल्लो भागमा (अर्थात्, श्वासनलीको लम्बाइको सट्टा जनावरको बायाँ वा दायाँ तिर) सारियो जब विशेषता आन्दोलनको ढाँचा परिवर्तन भयो।कणहरू अझै पनि तिनीहरूको आन्दोलनको समयमा स्पष्ट रूपमा देखिन्थे, तर जब चुम्बकलाई श्वासनलीबाट हटाइयो, कणको तारका टिपहरू देखिन थाल्यो (सप्लिमेन्टरी भिडियो S8: MP5 हेर्नुहोस्, 0:08 मा सुरु हुँदै)।यो एक गिलास केशिका मा लागू चुम्बकीय क्षेत्र को कार्य अन्तर्गत चुम्बकीय क्षेत्र को अवलोकन व्यवहार संग सहमत छ।
लाइभ एनेस्थेटाइज्ड मुसाको श्वासनलीमा MP5 देखाउने नमूना छविहरू।(a) चुम्बकलाई श्वासनलीको माथि र बायाँपट्टि छविहरू प्राप्त गर्न प्रयोग गरिन्छ, त्यसपछि (b) चुम्बकलाई दायाँतिर सार्दा।रातो बाकसले कन्ट्रास्ट बढाउने म्याग्निफिकेसनलाई संकेत गर्छ।यी तस्बिरहरू S7 को पूरक भिडियो: MP5 मा चित्रित भिडियोबाट हुन्।
जब दुई ध्रुवहरूलाई श्वासनलीको माथि र तल उत्तर-दक्षिण अभिमुखीकरणमा ट्युन गरिएको थियो (अर्थात, आकर्षित गर्दै; चित्र 3b), MP कर्डहरू लामो देखिन्थे र श्वासनलीको पृष्ठीय सतहमा नभई श्वासनलीको पार्श्व पर्खालमा अवस्थित थिए। श्वासनली (परिशिष्ट हेर्नुहोस्)।भिडियो S9:MP5)।यद्यपि, एक साइटमा कणहरूको उच्च सांद्रता (अर्थात, श्वासनलीको पृष्ठीय सतह) दोहोरो चुम्बक उपकरण प्रयोग गरेर तरल पदार्थ व्यवस्थापन पछि पत्ता लागेन, जुन सामान्यतया एकल चुम्बक उपकरणसँग हुन्छ।त्यसपछि, जब एक चुम्बकलाई विपरीत ध्रुवहरू (चित्र 3c) हटाउन कन्फिगर गरिएको थियो, दृश्यको क्षेत्रमा देखिने कणहरूको संख्या डेलिभरी पछि बढेको थिएन।दुबै चुम्बक कन्फिगरेसनहरू सेट अप गर्नु उच्च चुम्बकीय क्षेत्र बलको कारणले चुनौतीपूर्ण छ जसले चुम्बकहरूलाई क्रमशः आकर्षित वा धक्का दिन्छ।त्यसपछि सेटअप वायुमार्गको समानान्तर एकल चुम्बकमा परिवर्तन गरिएको थियो तर वायुमार्गबाट ​​90 डिग्री कोणमा गुज्रिएको थियो ताकि बलको रेखाहरूले ट्रेकियल पर्खाललाई ओर्थोगोनली पार गर्यो (चित्र 3d), एक अभिमुखीकरणमा कण एकत्रीकरणको सम्भावना निर्धारण गर्ने उद्देश्यले। पार्श्व पर्खाल।अवलोकन गर्नुपर्छ।यद्यपि, यस कन्फिगरेसनमा, त्यहाँ कुनै पहिचान योग्य MF संचय आन्दोलन वा चुम्बक आन्दोलन थिएन।यी सबै नतिजाहरूको आधारमा, जीन वाहकहरूको भिभो अध्ययनका लागि एकल चुम्बक र 30-डिग्री अभिमुखीकरणको कन्फिगरेसन छनोट गरियो (चित्र 3a)।
जब जनावरलाई मानवीय रूपमा बलिदान गरिसकेपछि तुरुन्तै धेरै पटक चित्रण गरिएको थियो, हस्तक्षेप गर्ने तन्तु गतिको अनुपस्थितिको अर्थ चुम्बकको अनुवादात्मक गतिको अनुसार स्पष्ट इन्टरकार्टिलागिनस फिल्डमा 'स्वेइङ', सूक्ष्म, छोटो कण रेखाहरू बुझ्न सकिन्छ।MP6 कणहरूको उपस्थिति र आन्दोलन स्पष्ट रूपमा हेर्नुहोस्।
LV-LacZ को टाइटर 1.8 x 108 IU/mL थियो, र CombiMag MP (MP6) सँग 1:1 मिश्रण गरेपछि, जनावरहरूलाई LV वाहनको 9 x 107 IU/ml को 50 μl को ट्रेकियल डोजको साथ इन्जेक्सन गरियो (अर्थात् 4.5। x 106 TU/rat)।))।यी अध्ययनहरूमा, श्रमको समयमा चुम्बक सार्नुको सट्टा, हामीले चुम्बकलाई एउटै स्थितिमा निर्धारण गर्यौं कि LV ट्रान्सडक्शन (a) चुम्बकीय क्षेत्रको अनुपस्थितिमा भेक्टर डेलिभरीको तुलनामा सुधार गर्न सकिन्छ, र (b) यदि वायुमार्गले गर्न सक्छ भने। केन्द्रित हुनु।कोशिकाहरू माथिल्लो श्वासप्रश्वास पथको चुम्बकीय लक्ष्य क्षेत्रहरूमा ट्रान्सड्युस गरिएको छ।
चुम्बकको उपस्थिति र LV भेक्टरहरूसँग संयोजनमा CombiMag को प्रयोगले हाम्रो मानक LV भेक्टर डेलिभरी प्रोटोकलले जस्तै, पशु स्वास्थ्यलाई प्रतिकूल असर गरेको देखिएन।मेकानिकल गडबडी (पूरक चित्र 1) ले ट्रेकियल क्षेत्रको अगाडिको छविहरूले LV-MP उपचार गरिएको समूहमा चुम्बकको उपस्थितिमा पारगमनको उच्च स्तर रहेको देखाएको छ (चित्र 9a)।नीलो LacZ दागको एक सानो मात्रा मात्र नियन्त्रण समूह (चित्रा 9b) मा उपस्थित थियो।X-Gal-स्टेन्ड सामान्यीकृत क्षेत्रहरूको परिमाणीकरणले चुम्बकीय क्षेत्रको उपस्थितिमा LV-MP को प्रशासनले लगभग 6-गुना सुधार (चित्र 9c) भएको देखाएको छ।
LV-MP (a) चुम्बकीय क्षेत्रको उपस्थितिमा र (b) चुम्बकको अनुपस्थितिमा ट्रेचियल ट्रान्सडक्शन देखाउने समग्र छविहरूको उदाहरण।(c) चुम्बकको प्रयोगको साथ ट्रेकिआमा LacZ ट्रान्सडक्शनको सामान्यीकृत क्षेत्रमा सांख्यिकीय रूपमा महत्त्वपूर्ण सुधार (*p = 0.029, t-test, n = 3 प्रति समूह, मतलब ± मानक त्रुटि)।
तटस्थ छिटो रातो दाग खण्डहरू (पूरक चित्र 2 मा देखाइएको उदाहरण) ले संकेत गर्यो कि LacZ-स्टेन्ड सेलहरू उही नमूनामा र पहिले रिपोर्ट गरिएको उही स्थानमा उपस्थित थिए।
एयरवे जीन थेरापीमा प्रमुख चुनौती चासोका क्षेत्रहरूमा क्यारियर कणहरूको सटीक स्थानीयकरण र वायुप्रवाह र सक्रिय म्यूकस क्लियरेन्सको उपस्थितिमा मोबाइल फोक्सोमा उच्च स्तरको ट्रान्सडक्शन दक्षताको उपलब्धि रहेको छ।सिस्टिक फाइब्रोसिसमा श्वासप्रश्वाससम्बन्धी रोगहरूको उपचारको लागि अभिप्रेरित LV वाहकहरूको लागि, प्रवाहकीय वायुमार्गहरूमा वाहक कणहरूको निवास समय बढाउनु अहिलेसम्म एक अप्राप्य लक्ष्य भएको छ।Castellani et al. द्वारा औंल्याए अनुसार, ट्रान्सडक्शन बढाउन चुम्बकीय क्षेत्रहरूको प्रयोगले अन्य जीन वितरण विधिहरू जस्तै इलेक्ट्रोपोरेसनमा फाइदाहरू छन् किनभने यसले सरलता, अर्थव्यवस्था, स्थानीय वितरण, बढेको दक्षता, र छोटो इन्क्युबेशन समय संयोजन गर्न सक्छ।र सम्भवतः वाहन १० को कम खुराक।यद्यपि, vivo मा बाह्य चुम्बकीय शक्तिहरूको प्रभावमा वायुमार्गमा चुम्बकीय कणहरूको निक्षेप र व्यवहार कहिल्यै वर्णन गरिएको छैन, र वास्तवमा अक्षुण्ण जीवित वायुमार्गहरूमा जीन अभिव्यक्ति स्तरहरू बढाउन यो विधिको क्षमता vivo मा प्रदर्शन गरिएको छैन।
PCXI synchrotron मा हाम्रो इन भिट्रो प्रयोगहरूले MP polystyrene को अपवाद बाहेक हामीले परीक्षण गरेका सबै कणहरू हामीले प्रयोग गरेको इमेजिङ सेटअपमा देखिने देखाएको छ।चुम्बकीय क्षेत्रको उपस्थितिमा, चुम्बकीय क्षेत्रहरूले तारहरू बनाउँछन्, जसको लम्बाइ कणहरूको प्रकार र चुम्बकीय क्षेत्रको बल (अर्थात, चुम्बकको निकटता र आन्दोलन) सँग सम्बन्धित छ।चित्र 10 मा देखाइए अनुसार, हामीले अवलोकन गरेका तारहरू प्रत्येक एकल कण चुम्बकीकृत हुने र यसको आफ्नै स्थानीय चुम्बकीय क्षेत्रलाई प्रेरित गर्दा बनाइन्छ।यी छुट्टाछुट्टै क्षेत्रहरूले अन्य समान कणहरूलाई सङ्कलन गर्न र समूह स्ट्रिङ गतिहरूसँग जोड्ने कारणले गर्दा स्थानीय बलहरूको आकर्षण र अन्य कणहरूको प्रतिकर्षणको कारणले गर्दा।
रेखाचित्र (a, b) तरल पदार्थले भरिएको केशिका भित्र बन्ने कणहरूको चेन र (c, d) हावाले भरिएको ट्रेकिआ देखाउँदै।ध्यान दिनुहोस् कि केशिकाहरू र श्वासनली स्केलमा तानिएका छैनन्।प्यानल (ए) ले चेनहरूमा मिलाइएको Fe3O4 कणहरू समावेश गर्ने MF को विवरण समावेश गर्दछ।
जब चुम्बक केशिका माथि सारियो, कण स्ट्रिङको कोण MP3-5 को Fe3O4 को लागि महत्वपूर्ण थ्रेसहोल्डमा पुग्यो, त्यसपछि कण स्ट्रिङ आफ्नो मूल स्थितिमा रहँदैन, तर सतहसँगै नयाँ स्थितिमा सारियो।चुम्बक।यो प्रभाव सम्भवतः हुन्छ किनभने गिलास केशिकाको सतह यो आन्दोलन हुन अनुमति दिन पर्याप्त चिकनी छ।चाखलाग्दो कुरा के छ भने, MP6 (CombiMag) ले यस तरिकाले व्यवहार गरेन, हुनसक्छ किनभने कणहरू साना थिए, फरक कोटिंग वा सतह चार्ज थियो, वा स्वामित्व वाहक तरल पदार्थले तिनीहरूको सार्न सक्ने क्षमतालाई असर गर्यो।CombiMag कण छविमा कन्ट्रास्ट पनि कमजोर छ, सुझाव दिन्छ कि तरल र कणहरू समान घनत्व हुन सक्छन् र त्यसैले सजिलै एकअर्का तिर जान सक्दैनन्।चुम्बकीय क्षेत्र बलले तरल पदार्थमा भएका कणहरू बीचको घर्षणलाई सधैँ चुम्बकीय क्षेत्रको शक्तिले जित्न सक्दैन भनी सङ्केत गर्छ भने चुम्बकीय क्षेत्र बल र चुम्बक र लक्षित क्षेत्रबीचको दूरीलाई नआउने सुझाव दिन्छ। आश्चर्य।महत्त्वपूर्ण।यी नतिजाहरूले यो पनि संकेत गर्दछ कि यद्यपि चुम्बकहरूले लक्षित क्षेत्रबाट बग्ने धेरै सूक्ष्म कणहरू कब्जा गर्न सक्दछन्, यो सम्भव छैन कि चुम्बकहरू श्वासनलीको सतहमा CombiMag कणहरू सार्नको लागि भर पर्न सकिन्छ।यसरी, हामीले निष्कर्ष निकाल्यौं कि vivo LV MF अध्ययनहरूले स्थिर चुम्बकीय क्षेत्रहरू प्रयोग गर्नुपर्दछ शारीरिक रूपमा वायुमार्ग रूखको विशिष्ट क्षेत्रहरूलाई लक्षित गर्न।
एक पटक कणहरू शरीरमा डेलिभर गरिसकेपछि, तिनीहरू शरीरको जटिल गतिशील टिश्यूको सन्दर्भमा पहिचान गर्न गाह्रो हुन्छ, तर MP स्ट्रिङहरूलाई "विगल" गर्न चुम्बकलाई ट्रेकिआमा तेर्सो रूपमा सारेर तिनीहरूको पत्ता लगाउने क्षमता सुधार गरिएको छ।वास्तविक-समय इमेजिङ सम्भव भएमा, जनावरलाई मानवीय रूपमा मारिएपछि कणको गति पत्ता लगाउन सजिलो हुन्छ।यस स्थानमा MP सांद्रता सामान्यतया उच्चतम थियो जब चुम्बक इमेजिङ क्षेत्रमा राखिएको थियो, यद्यपि केही कणहरू सामान्यतया ट्रेकिआको तल फेला परेका थिए।भिट्रो अध्ययनहरूमा विपरीत, चुम्बकको आन्दोलनद्वारा कणहरूलाई ट्रेकिआमा तान्न सकिँदैन।यो खोजले श्वासनलीको सतहलाई कभर गर्ने श्लेष्मले सामान्यतया सास लिने कणहरूलाई कसरी श्लेष्ममा फसाउँछ र पछि म्यूको-सिलियरी क्लियरेन्स मेकानिज्म मार्फत सफा गर्छ भन्नेसँग मिल्दोजुल्दो छ।
हामीले परिकल्पना गरेका थियौं कि श्वासनलीको माथि र तल आकर्षणको लागि चुम्बकहरू प्रयोग गर्दा (चित्र 3b) एक बिन्दुमा अत्यधिक केन्द्रित चुम्बकीय क्षेत्रको सट्टा अधिक समान चुम्बकीय क्षेत्र हुन सक्छ, सम्भावित रूपमा कणहरूको अधिक समान वितरणको परिणाम हो।।यद्यपि, हाम्रो प्रारम्भिक अध्ययनले यस परिकल्पनालाई समर्थन गर्ने स्पष्ट प्रमाण फेला पारेन।त्यसै गरी, चुम्बकको जोडीलाई रिपुल्स (चित्र 3c) मा सेट गर्दा छवि क्षेत्रमा थप कणहरू बस्ने परिणाम भएन।यी दुई खोजहरूले देखाउँछन् कि दोहोरो-चुम्बक सेटअपले MP पोइन्टिङको स्थानीय नियन्त्रणमा उल्लेखनीय रूपमा सुधार गर्दैन, र परिणामस्वरूप बलियो चुम्बकीय बलहरू ट्यून गर्न गाह्रो छ, यस दृष्टिकोणलाई कम व्यावहारिक बनाउँदै।त्यसै गरी, माथि र श्वासनली (चित्र 3d) मा चुम्बकलाई अभिमुखीकरण गर्दा पनि इमेज गरिएको क्षेत्रमा बाँकी कणहरूको संख्या बढेको छैन।यी मध्ये केही वैकल्पिक कन्फिगरेसनहरू सफल नहुन सक्छन् किनभने तिनीहरूले निक्षेप क्षेत्रमा चुम्बकीय क्षेत्रको शक्तिमा कमी ल्याउन सक्छन्।यसरी, 30 डिग्री (चित्र 3a) मा एकल चुम्बक कन्फिगरेसनलाई भिभो परीक्षण विधिमा सबैभन्दा सरल र सबैभन्दा प्रभावकारी मानिन्छ।
LV-MP अध्ययनले देखाएको छ कि जब LV भेक्टरहरू CombiMag सँग जोडिएको थियो र चुम्बकीय क्षेत्रको उपस्थितिमा शारीरिक रूपमा गडबड भएपछि वितरण गरिएको थियो, नियन्त्रणको तुलनामा श्वासनलीमा ट्रान्सडक्शन स्तरहरू उल्लेखनीय रूपमा बढेको थियो।सिन्क्रोट्रोन इमेजिङ अध्ययन र LacZ नतिजाहरूको आधारमा, चुम्बकीय क्षेत्रले LV लाई श्वासनलीमा राख्न र फोक्सोमा तुरुन्तै गहिरो प्रवेश गर्ने भेक्टर कणहरूको संख्या घटाउन सक्षम भएको देखियो।त्यस्ता लक्ष्यीकरण सुधारहरूले डेलिभर गरिएका टाइटरहरू, गैर-लक्षित ट्रान्सडक्शन, भडकाऊ र प्रतिरक्षा साइड इफेक्टहरू, र जीन स्थानान्तरण लागतहरू कम गर्दा उच्च दक्षता निम्त्याउन सक्छ।महत्त्वपूर्ण रूपमा, निर्माताका अनुसार, CombiMag लाई अन्य भाइरल भेक्टरहरू (जस्तै AAV) र न्यूक्लिक एसिडहरू सहित अन्य जीन स्थानान्तरण विधिहरूसँग संयोजनमा प्रयोग गर्न सकिन्छ।