Giardia duodenum एक परजीवी जीव हो जसले giardiasis निम्त्याउँछ, एक आन्द्राको संक्रमण विशेष गरी साना बच्चाहरूमा पखालाको क्लिनिकल संकेतहरू भएकामा सामान्य हुन्छ।हामीले पहिले रिपोर्ट गरेका छौं कि एक्स्ट्रासेलुलर G. duodenalis ले intracellular oligomerization-like रिसेप्टर 3 (NLRP3) बाध्यकारी न्यूक्लियोटाइडहरूको सक्रियता ट्रिगर गर्दछ र एक्स्ट्रासेलुलर भेसिकल (EV) स्राव मार्फत होस्ट भडकाऊ प्रतिक्रियाहरूलाई नियमन गर्दछ।यद्यपि, यस प्रक्रियामा संलग्न रोगजनक-सम्बद्ध डुओडेनोकोकल EV (GEV) को सही आणविक ढाँचाहरू र giardiasis मा NLRP3 इन्फ्लामासोमको भूमिका स्पष्ट हुन बाँकी छ।
GEV मा पुन: संयोजक युकेरियोटिक अभिव्यक्ति प्लाज्मिडहरू pcDNA3.1(+)-alpha-2 र alpha-7.3 giardins को निर्माण गरिएको थियो, माउस प्राथमिक पेरिटोनियल म्याक्रोफेजहरूमा रूपान्तरण गरिएको थियो, र सूजन लक्ष्य अणु क्यास्पेस-1 मापन गरेर पत्ता लगाइएको थियो।p20 अभिव्यक्ति स्तर स्क्रिन गरिएको थियो।।G. duodenalis alpha-2 र alpha-7.3 giardines मूलतः NLRP3 inflammasome (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 र caspase-1 p20), IL स्राव मापन गरेर पहिचान गरिएको थियो।1β स्तरहरू, एपोप्टोटिक स्पट प्रोटीन (एएससी) ओलिगोमराइजेशन स्तरहरू, र एनएलआरपी3 र एएससीको इम्युनोफ्लोरोसेन्ट स्थानीयकरण।G. duodenalis को pathogenicity मा NLRP3 inflammasome को भूमिका त्यसपछि NLRP3 सक्रियता अवरुद्ध (NLRP3 अवरुद्ध चूहों) र शरीरको तौल, ग्रहणी परजीवी भार, र ग्रहणी ऊतक मा रोगविज्ञान परिवर्तन को उपयोग गरी मूल्याङ्कन गरिएको थियो।थप रूपमा, हामीले hiardines alpha-2 र alpha-7.3 ले NLRP3 inflammasome मार्फत vivo मा IL-1β स्राव उत्प्रेरित गर्छ कि भनेर अनुसन्धान गर्यौं र मुसाहरूमा G. duodenalis को रोगजनकतामा यी अणुहरूको भूमिका निर्धारण गर्यौं।
Alpha-2 र alpha-7.3 giardines ले भिट्रोमा NLRP3 इन्फ्लामासोमको सक्रियतालाई प्रेरित गर्छ।यसले p20 क्यास्पेस-1 को सक्रियताको नेतृत्व गर्‍यो, NLRP3, प्रो-IL-1β, र प्रो-क्यास्पेस-1 प्रोटीनहरूको अभिव्यक्ति स्तरमा वृद्धि, IL-1β स्रावमा उल्लेखनीय वृद्धि, एएसए स्पटहरूको गठन। cytoplasm, र ASA oligomerization को प्रेरण।NLRP3 सूजन पेनाइल हानिले मुसामा G. duodenalis को रोगजनकता बढाउँछ।NLRP3-ब्लक गरिएको मुसाबाट ग्याभेजद्वारा सिस्टको उपचार गरिएको मुसाले ट्रोफोजोइट्सको बढ्दो संख्या र ड्युओडेनल भिल्लीमा गम्भीर क्षति देखाएको छ, जसमा नेक्रोटिक क्रिप्टहरू खुम्चिएका र शाखाहरू छन्।भिभोमा प्रयोगहरूले देखाएको छ कि giardines alpha-2 र alpha-7.3 ले NLRP3 inflammasome मार्फत IL-1β को स्राव उत्प्रेरित गर्न सक्छ, र giardines alpha-2 र alpha-7.3 को खोपले मुसामा G. duodenalis को रोगजनकता कम गर्यो।
सँगै लिइएको, यस अध्ययनको नतिजाले सुझाव दिन्छ कि giardia alpha-2 र alpha-7.3 ले होस्ट NLRP3 सूजनको अपरेग्युलेसन गर्दछ र मुसामा G. duodenalis को संक्रामकता कम गर्दछ, जुन giardiasis रोक्नको लागि आशाजनक लक्ष्यहरू छन्।
Giardia duodenum एउटा एक्स्ट्रासेल्युलर प्रोटोजोआन परजीवी हो जुन सानो आन्द्रामा बस्छ र वार्षिक रूपमा, विशेष गरी विकासशील देशहरूमा साना बालबालिकाहरूमा giardiasis को 280 मिलियन केसहरू निम्त्याउँछ।मानिसहरु पिउने पानी वा खानेकुरा दूषित M. duodenum cysts बाट संक्रमित हुन्छन्, जुन पछि पेटमा प्रवेश गरी ग्यास्ट्रिक जुसमा उत्सर्जित हुन्छ।Giardia duodenum trophozoites ड्युओडेनल एपिथेलियममा संलग्न हुन्छन्, जसले गर्दा वाकवाकी, बान्ता, पखाला, पेट दुख्ने र तौल घट्ने गर्छ।इम्युनोडेफिशियन्सी र सिस्टिक फाइब्रोसिस भएका व्यक्तिहरू संक्रमणको लागि संवेदनशील हुन्छन्।मुख र गुदा सेक्सबाट पनि संक्रमण हुन सक्छ [२]।मेट्रोनिडाजोल, टिनिडाजोल, र nitazoxanide जस्ता औषधिहरू ड्युओडेनल इन्फेक्सनको लागि रुचाइएको उपचार विकल्प हुन् [३]।यद्यपि, यी केमोथेरापी औषधिहरूले प्रतिकूल साइड इफेक्टहरू निम्त्याउँछ जस्तै वाकवाकी, कार्सिनोजेनेसिस, र जीनोटक्सिसिटी [४]।तसर्थ, G. duodenalis संक्रमण रोक्न थप प्रभावकारी रणनीतिहरू विकास गर्न आवश्यक छ।
इन्फ्लामासोमहरू साइटोसोलिक प्रोटीन कम्प्लेक्सको एक वर्ग हुन् जुन जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाको हिस्सा हो, रोगजनक आक्रमण र मध्यस्थता भडकाऊ प्रतिक्रियाहरू विरुद्ध रक्षा गर्न मद्दत गर्दछ [5]।यी इन्फ्लामासोमहरू मध्ये, nucleotide-binding oligomerization (NOD) रिसेप्टर 3 (NLRP3) nucleotide-binding oligomerization (NLRP3) nucleotide-binding-like inflammasome को व्यापक रूपमा अध्ययन गरिएको छ किनभने यो विभिन्न रोगजनक / ढाँचा द्वारा पत्ता लगाउन सकिन्छ। DAMP), पहिचान गर्दछ, जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली सक्रिय गर्दछ।र धेरै भडकाऊ रोगहरूमा आंतोंको होमियोस्टेसिसलाई विनियमित गर्दछ [6,7,8]।यसमा ढाँचा पहिचान रिसेप्टर (PRR) NLRP3, एक एडाप्टर एपोप्टोटिक स्पट प्रोटीन (ASC), र एक प्रभावकर्ता प्रोकास्पेस-1 वा प्रोकास्पेस-11 समावेश छ।NLRP3 इन्फ्लामासोमले रोगजनक आक्रमणको बिरूद्ध एक होस्टको रूपमा कार्य गर्दछ, नियोस्पोरा क्यानिनम [९], प्याराकोक्सीडियोइड्स ब्रासिलिलेन्सिस [१०], र लीशम्यानिया अध्ययनहरूमा देखाइएको छ।[११], तर यो पनि रिपोर्ट गरिएको छ कि NLRP3 इन्फ्लामासोमको सक्रियताले सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाहरूलाई सीमित गर्दछ र रोगको प्रगतिलाई बढाउँछ, उदाहरणका लागि, कीड़ेहरूमा [१२]।हाम्रो अघिल्लो खोजहरूको आधारमा, हामीले रिपोर्ट गर्‍यौं कि एक्स्ट्रासेलुलर G. डुओडेनालिसले NLRP3 सूजनको इन्ट्रासेलुलर सक्रियता ट्रिगर गर्दछ र एक्स्ट्रासेलुलर भेसिकल (EVs) [१३] स्राव गरेर होस्ट भडकाउने प्रतिक्रियाहरू परिमार्जन गर्दछ।यद्यपि, भिभोमा G. duodenalis संक्रमणमा NLRP3 इन्फ्लामासोमको भूमिका निर्धारण गर्न बाँकी छ।
Giardins लाई मूल रूपमा G. duodenalis cytoskeleton को संरचनात्मक घटकको रूपमा वर्णन गरिएको थियो र ट्रोफोजोइट गतिशीलता र सानो आन्द्रामा एपिथेलियल सेल संलग्नतामा महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छ।वातावरणमा राम्रोसँग अनुकूलन गर्न र तिनीहरूको रोगजनकता बढाउन, G. duodenalis trophozoites ले 8 flagella, 1 मध्य शरीर, र 1 ventral डिस्क [14] सम्मिलित एक अद्वितीय साइटोस्केलेटल संरचना विकास गर्यो।Giardia duodenum को trophozoites ले आफ्नो cytoskeleton को माथिल्लो सानो आन्द्रा, विशेष गरी ड्युओडेनम मा प्रवेश गर्न को लागी प्रयोग गर्दछ, र इन्टरोसाइटहरु लाई जोड्दछ।तिनीहरू निरन्तर माइग्रेट हुन्छन् र सेल मेटाबोलिज्म प्रयोग गरेर उपकला कक्षहरूमा संलग्न हुन्छन्।त्यसकारण, तिनीहरूको साइटोस्केलेटन र विषाणुको बीचमा नजिकको सम्बन्ध छ।Giardia duodenum को लागि विशिष्ट Giardines cytoskeleton संरचना [15] को घटक हुन् र चार वर्गमा विभाजित छन्: α-, β-, γ-, र δ-giardines।त्यहाँ α-giardin परिवारका 21 सदस्यहरू छन्, जसमध्ये सबैसँग फस्फोलिपिडहरू बाँध्ने क्याल्सियम-निर्भर क्षमता छ [16]।तिनीहरूले कोशिका झिल्लीमा साइटोस्केलेटन पनि जोड्छन्।G. duodenalis को कारणले पखाला भएका व्यक्तिहरूमा, α-giardins संक्रमणको समयमा अत्यधिक अभिव्यक्त र प्रतिरक्षा सक्रिय हुन्छन् [17]।जिआर्डिया अल्फा-१ मा आधारित हेटेरोलोगस भ्याक्सिनहरू मुसामा जिआर्डियासिसबाट सुरक्षित छन् र खोप विकासका लागि सम्भावित उम्मेद्वार एन्टिजेन्स हुन् [१८]।अल्फा-8 giardin, प्लाज्मा झिल्ली र फ्लाजेलामा स्थानीयकृत, तर भेन्ट्रल डिस्कमा होइन, G. duodenalis [19] मा ट्रोफोजोइट्सको गतिशीलता र वृद्धि दर बढाउँछ।Alpha-14 giardin फ्ल्यागेलामा माइक्रोट्यूब्युल संरचनाहरूमा संलग्न हुन्छ र G. duodenalis [20] को व्यवहार्यतालाई असर गर्छ।Alpha-11 giardine जीवन चक्र भर प्रशस्त मात्रामा उपस्थित हुन्छ, र alpha-11 giardine को overexpression ले G. duodenalis लाई क्षति पुर्‍याउँछ [21]।यद्यपि, यो स्पष्ट छैन कि अल्फा-२ जिआर्डिन र अल्फा-७.३ जिआर्डिन G. ड्युओडेनलिस संक्रमण र तिनीहरूको अन्तर्निहित संयन्त्रहरू विरुद्ध सुरक्षात्मक छन्।
यस अध्ययनमा, पुन: संयोजक युकेरियोटिक अभिव्यक्ति प्लाज्मिडहरू pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine र pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine लाई माउस प्राथमिक पेरिटोनियल म्याक्रोफेजहरूमा होस्ट NLRP3 सक्रिय गर्नको लागि रूपान्तरण गरिएको थियो।इन्फ्लामासोम लक्ष्यहरू त्यसपछि स्क्रीनिंग गरियो।हामीले G. duodenalis को pathogenicity मा NLRP3 inflammasome को भूमिकाको पनि मूल्याङ्कन गर्यौं, alpha-2 र alpha-7,3 giardines ले vivo मा NLRP3 inflammasome को सक्रियता गर्छ कि गर्दैन भनेर अनुसन्धान गर्‍यौं, र निर्धारण गर्‍यौं कि रोगजनकतामा giardines को यी दुई भूमिकाहरू। G. duodenalis।हाम्रो साझा लक्ष्य G. duodenalis संक्रमणको रोकथामको लागि आशाजनक लक्ष्यहरू विकास गर्नु थियो।
जंगली प्रकार (WT) C57BL/6 5-8 हप्ता उमेरका पोथी मुसाहरू Liaoning Changsheng प्रयोगात्मक पशु केन्द्र (Liaoning, China) बाट खरिद गरिएको थियो।मुसाहरूलाई पानीमा नि:शुल्क पहुँच थियो, निर्जंतुकीकरण गरिएको खाना प्राप्त भयो र 12/12 घण्टाको उज्यालो/अँध्यारो चक्रमा राखियो।संक्रमण हुनु अघि, मुसाहरूले एम्पिसिलिन (1 mg/mL), vancomycin (1 mg/mL), र neomycin (1.4 mg/mL) (सबै सांघाई, चीन, कृत्रिम जीवहरूबाट खरिद गरिएका) पिउने पानीमा एन्टिबायोटिक एड लिबिटम प्राप्त गरे। ]।]।24 घण्टा भन्दा बढी खाने र पिउने क्षमता गुमाउने र ≥ 20% शरीरको तौल गुमाउने मुसालाई पाठेघरको सर्भाइकल डिस्लोकेसनले मानवीय रूपमा ईथनाइज गरेको थियो।
WB G. duodenalis trophozoites (अमेरिकी प्रकार संस्कृति संग्रह, Manassas, USA) लाई 12.5% ​​भ्रूण बोवाइन सीरम (FBS; Every Green, Zhejiang, China) र 0.1% गोवाइन पित्त (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA) को साथ पूरक गरिएको थियो। )।संयुक्त राज्य अमेरिका) माइक्रोएरोबिक अवस्था अन्तर्गत।कन्फ्लुएन्ट ट्रोफोजोइटहरू बरफमा जम्मा गरियो र थप प्रजननको लागि 1:4 को अनुपातमा पार गरियो।
Giardia duodenum cysts लाई पहिले वर्णन गरिए अनुसार प्रेरित गरिएको थियो [23], ट्रोफोजोइटहरू लॉगरिदमिक चरणमा काटिएका थिए र त्यसपछि encapsulation inducing माध्यम, pH 7.1 (परिमार्जित TYI-S-33) 1 × 106 ट्रोफोजोइट्सको अन्तिम एकाग्रतामा पातलो गरियो।पित्त एकाग्रता ०.०५% मध्यम)।ट्रोफोजोइटहरू एनारोबिक अवस्थाहरूमा 37 डिग्री सेल्सियसमा लॉगरिथमिक वृद्धि चरणमा विकसित गरिएको थियो।माध्यमलाई सिस्ट इन्ड्युसिङ माध्यममा परिवर्तन गर्नुहोस् (pH 7.8; परिमार्जित TYI-S-33 मध्यम 1% पित्त एकाग्रताको साथ) र कल्चर G. ड्युओडेनालिस 37°C मा 48-96 घण्टाको लागि, जुन समयमा सिस्टहरू बनाइएको माइक्रोस्कोप अन्तर्गत अवलोकन गरियो।धेरैजसो ट्रोफोजोइट्सलाई सिस्ट बनाउन प्रेरित गरिसकेपछि, कल्चर मिश्रणलाई काटियो र बाँकी ट्रोफोजोइट्सलाई लाइज गर्न बाँझ डियोनाइज्ड पानीमा पुन: सस्पेन्ड गरियो।मुसामा ग्यास्ट्रिक ट्यूब मार्फत पछिको विश्लेषणको लागि सिस्टहरू गणना गरियो र 4 डिग्री सेल्सियसमा भण्डारण गरियो।
Giardia extracellular vesicles (GEVs) पहिले वर्णन गरिए अनुसार समृद्ध थिए [13]।लोगारिथमिक वृद्धि चरणमा ट्रोफोजोइटहरू परिमार्जित TYI-S-33 माध्यममा एक्सोसोम-ह्रास भएको FBS (जैविक उद्योग, Beit-Haemek, इजरायल) सँग 1 × 106 परजीवी/mL को अन्तिम एकाग्रतामा पुन: निलम्बन गरियो र 12 घण्टाको लागि इन्क्युबेटेड गरियो।10 मिनेटको लागि 2000 ग्राम, 45 मिनेटको लागि 10,000 ग्राम, र 60 मिनेटको लागि 100,000 ग्राम सेन्ट्रीफ्यूगेशनद्वारा कल्चर सुपरनेटान्टबाट अलग गरिएको थियो।फस्फेट बफर गरिएको सलाइन (PBS) मा अवक्षेपणहरू भंग गरियो, BCA प्रोटीन परख किट (थर्मो फिशर वैज्ञानिक, वाल्थम, एमए, संयुक्त राज्य अमेरिका) को प्रयोग गरेर मात्रा निर्धारण गरियो र -80° C. मा भण्डारण गरियो वा थप विश्लेषणको लागि सीधा प्रयोग गरियो।
प्राथमिक माउस पेरिटोनियल म्याक्रोफेजहरू पहिले वर्णन गरिए अनुसार तयार गरिएको थियो [२४]।छोटकरीमा, मुसा (६-८ हप्ता उमेरका) लाई २.५ मिलीलीटर २.९८% डिफको लिक्विड थायोग्लाइकोल मिडियम (बीडी, फ्र्याङ्कलिन लेक्स, एनजे, संयुक्त राज्य अमेरिका) इन्जेक्सन गरियो (इन्ट्रापेरिटोनली [आईपी]) र ३-४ तालु खुवाइयो।इच्छामृत्यु पछि मुसाको पेटको गुहाबाट म्याक्रोफेजको निलम्बन संकलन गरिएको थियो र १० मिनेटको लागि १००० ग्राममा ३ पटक सेन्ट्रीफ्युज गरिएको थियो।CD11b मार्करको प्रयोग गरेर कोशिका शुद्धता>98% नभएसम्म फ्लो साइटोमेट्रीद्वारा काटिएका कोशिकाहरू पत्ता लगाइयो, त्यसपछि 6-वेल सेल कल्चर प्लेटहरू (4.5 x 106 कोशिकाहरू/वेल) मा थपियो र 10% FBS (बायोइन्डस्ट्री) 37°C मा इन्क्युबेटेड गरियो।र 5% CO2।
TRIzol अभिकर्मक (Vazyme, Nanjing, China) को 1 ml मा 1 × 107 trophozoites बाट RNA निकालिएको थियो, MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, China) को प्रयोग गरेर कुल G. duodenalis RNA बाट जीनोमिक DNA निकालिएको थियो र पूरक DNA (scDNA) लाई सिंक गरिएको थियो। निर्माताको निर्देशन अनुसार MonScript RTIIII सुपर मिक्स (मोनाड) प्रयोग गर्दै।
लक्ष्य G. duodenalis जीनको लागि CDS अनुक्रम जानकारी NCBI GenBank बाट प्राप्त गरिएको थियो।प्राइमर 5.0 प्रयोग गर्नुहोस् प्रत्येक लक्षित जीनको लागि विशिष्ट सिमलेस क्लोनिङ प्राइमरहरू डिजाइन गर्न।फर्वार्ड प्राइमर (5′-3′) मा तीन भागहरू हुन्छन्: एक रेखीय भेक्टर pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) सँग ओभरल्यापिङ अनुक्रम र ATG र GNN सुरु गर्नुहोस् (यदि पहिलो आधार G छैन भने)।यो अभिव्यक्ति को दक्षता सुधार गर्न को लागी गरिन्छ।थप रूपमा, कम्तिमा 16 bp संयुक्त आधारहरू (GC सामग्री 40–60%/Tm लगभग 55 °C)।रिभर्स प्राइमर (5′-3′) मा दुई भागहरू हुन्छन्, EcoRV-लाइनराइज्ड भेक्टर pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) र कम्तिमा 16 bp को संयुक्त आधारको साथ ओभरल्यापिङ अनुक्रम।(अन्तिम दुई स्टपहरू बाहेक)।आधारहरू) एक कोडोन जस्तै AA वा GA पुनः संयोजक प्लाज्मिडहरूलाई तिनीहरूको लेबल गरिएको प्रोटीनहरू व्यक्त गर्न अनुमति दिन।प्राइमर अनुक्रमहरू तालिका 1 मा सूचीबद्ध छन् र Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, China) द्वारा संश्लेषित गरिएको थियो।
Pfu DNA पोलिमरेज (Tiangen, Beijing, China) वा Ex-taq (Takara बायोमेडिकल टेक्नोलोजी [Beijing] Co., Ltd., Beijing, China) को टेम्प्लेटको रूपमा तयार गरिएको G. duodenalis cDNA प्रयोग गरेर लक्ष्यहरू विस्तार गरिएको थियो।युकेरियोटिक अभिव्यक्ति भेक्टर प्लाज्मिड pcDNA3.1(+) लाई प्रतिबन्ध इन्जाइम EcoRV र फास्ट एपी (थर्मो फिशर साइंटिफिक) को प्रयोग गरेर डिफोस्फोराइलेटेडसँग रेखीय गरिएको थियो।Linearized pcDNA3.1(+) टुक्राहरू र एम्प्लीफाइड लक्ष्य जीन टुक्राहरू DNA जेल शुद्धिकरण किट (Tiangen) प्रयोग गरेर शुद्ध गरियो र Nanodrop ND-2000 (थर्मो फिशर वैज्ञानिक) प्रयोग गरेर परिमाण निर्धारण गरियो।pcDNA3.1(+) टुक्रा र प्रत्येक लक्षित जीन टुक्रा MonClone एकल एसेम्बली क्लोनिङ मिक्स (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, China) को प्रयोग गरेर पुन: संयोजित गरियो र Comate Bioscience Company Limited (Changchun, China) को प्रयोग गरेर DNA अनुक्रमण द्वारा पुष्टि गरियो।।
एन्डोटोक्सिन-मुक्त प्लाज्मिडहरू pcDNA3.1(+)-alpha-2 र pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 SanPrep Endotoxin-free Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech) को प्रयोग गरेर उत्पन्न गरिएको थियो।इल्युसन बफरमा रहेको EDTA ले ट्रान्सफेक्सन परखमा हस्तक्षेप नगरेको सुनिश्चित गर्न 500 ng/μl भन्दा माथि एकाग्रता कायम गरिएको थियो।प्राथमिक माउस पेरिटोनियल म्याक्रोफेजहरू 6-वेल प्लेटहरूमा 12 घण्टाको लागि पूर्ण RPMI 1640 माध्यम (जैविक उद्योग) संग कल्चर गरिएको थियो, त्यसपछि कोशिकाहरूलाई 3 पटक न्यानो PBS मा पेनिसिलिन र स्ट्रेप्टोमाइसिन हटाउनको लागि धोइयो, र त्यसपछि मध्यममा पूर्ण माध्यमको साथ पूरक गरियो।एन्डोटोक्सिन-मुक्त प्लाज्मिडहरू pcDNA3.1(+)-alpha-2 र pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2.5 μg) Opti-MEM कम गरिएको सीरम माध्यम (Gibco, Thermo Fisher Scientific) को 125 μl मा पातलो गरियो।।त्यसपछि Lipofectamine 2000 ट्रान्सफेक्सन अभिकर्मक (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) को 5 μl कम सीरम Opti-MEM माध्यमको 125 μl मा पातलो गरियो।Lipofectamine 2000 सँग पातलो एन्डोटक्सिन-मुक्त प्लाज्मिड मिलाएर र मिश्रणलाई 5 मिनेटको लागि कोठाको तापक्रममा खडा गर्न अनुमति दिएर liposome-DNA कम्प्लेक्सहरू तयार गर्नुहोस्।कम्प्लेक्सहरू प्रत्येक इनारको कक्षहरूमा अलग-अलग स्थानान्तरण गर्नुहोस् र बिस्तारै मिश्रण गर्नुहोस्।4 घण्टा पछि, सेल कल्चर माध्यमलाई पूर्ण RPMI 1640 माध्यमको 2 मिलीलीटरले प्रतिस्थापन गरियो र कल्चरलाई 24 घण्टाको लागि जारी राखियो।ताजा सेल संस्कृति माध्यम कोशिकाहरूमा थपियो र परख डिजाइनको आधारमा विभिन्न समय बिन्दुहरूको लागि इन्क्युबेटेड गरियो।
supernatants र सेल lysates बाट प्रोटीन नमूनाहरू पहिले वर्णन गरिए अनुसार तयार गरिएको थियो [25]।pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-actin, र His-tag को लागि झिल्ली स्थानान्तरण प्यारामिटरहरू 200 mA/90 मिनेट थिए।Interleukin 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), caspase-1 (p20) (Adipogen, Switzerland) र NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Switzerland) र 1:5000 लाई लक्षित गर्दै उनको ट्याग (Amylet Scientific, Amylet Scientific) को लागि वुहान, चीन) र β-एकटिन (प्रोटिनटेक, वुहान, चीन)।
Disuccinimide suberate (DSS) सँग क्रस-लिङ्किङ पहिले वर्णन गरिए अनुसार प्रदर्शन गरिएको थियो [26]।कोशिकाहरूलाई ३ पटक चिसो पीबीएसले धोइयो र ५० μl ASC प्रतिक्रिया बफर (pH 8.0) मा 25 mM Na2PO4, 187.5 mM NaCl, 25 mM HEPES र 125 mM NaHCO3 भएको 27 गेज सुईले पूर्ण रूपमा लिइयो।मिश्रणलाई 3 मिनेटको लागि 5000 ग्राममा सेन्ट्रीफ्युज गरिएको थियो र गोलीलाई 10 μl DSS (DMSO मा 25 mM) र 37 ° C मा 30 मिनेटको लागि 40 μl ASC प्रतिक्रिया बफरसँग टाँसिएको थियो।10 मिनेटको लागि 5000 ग्राममा सेन्ट्रीफ्यूगेशन पछि, गोली 40 μl ASC प्रतिक्रिया बफर र 6x प्रोटीन लोडिङ बफर (ट्रान्सजेन, बेइजिङ, चीन) को 10 μl को समाधानमा भंग गरियो र त्यसपछि 15 को लागि कोठाको तापक्रममा समाधान निभाइयो। मिनेट, त्यसपछि 10 मिनेट उमाल्नुहोस्।प्रोटीन नमूनाहरू त्यसपछि 1:500 को कमजोर अनुपातमा प्राथमिक एन्टि-एएससी एन्टिबडीहरू (वानलेबियो, शेनयाङ, चीन) प्रयोग गरेर पश्चिमी ब्लटिङको अधीनमा थिए।
पहिले वर्णन गरिएको प्रक्रिया [१३] पछ्याउँदै, सेल कल्चर सुपरनेटेन्टहरू काटियो र प्रो-इन्फ्लेमेटरी साइटोकाइन IL-1β को स्राव माउस IL-1 Beta ELISA kit (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) को प्रयोग गरेर निर्धारण गरिएको थियो।OD450nm मानहरूलाई IL-1β मानक वक्र प्रयोग गरेर प्रोटिन सांद्रतामा रूपान्तरण गर्नुहोस्।
कभरस्लिपमा लेपित सेलहरूलाई न्यानो PBS मा 3 पटक बिस्तारै धोइयो, टिस्यु सेल फिक्सेटिभ (बायोशार्प, बेइजिङ, चीन) मा १० मिनेटको लागि कोठाको तापक्रम (RT) मा फिक्स गरियो, ०.१% ट्राइटन एक्स-पर्मेबिलाइज १०० मा (पीबीएसमा पातलो; बायोशार्प। ) कोठाको तापक्रममा २० मिनेटको लागि र कोठाको तापक्रममा २ घण्टाको लागि ५% बोवाइन सीरम अल्बुमिन (पीबीएसमा) ब्लक गर्नुहोस्।त्यसपछि कोशिकाहरूलाई क्रमशः ASC (1:100 dilution) वा NLRP3 (1:100 dilution) विरुद्ध प्राथमिक एन्टिबडीहरूसहित 4°C मा रातभर इन्क्युबेटेड गरियो, र Cy3 ले गोट एन्टी-रेबिट IgG(H+L) (1:400; EarthOx) लेबल लगाइयो। , सान फ्रान्सिस्को, CA, USA) वा FITC-संयुग्मित बाख्रा एन्टी-माउस IgG (1:400; अर्थक्स) रातभर 37 डिग्री सेल्सियसमा 1 घण्टाको लागि अँध्यारोमा।नाभिकहरूलाई Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, China) 5 मिनेटको लागि दाग गरिएको थियो र फ्लोरोसेन्स माइक्रोस्कोप (Olympus Corporation, Tokyo, Japan) अन्तर्गत अवलोकन गरियो।
मुसाहरूलाई चार समूहमा विभाजन गरिएको थियो (प्रत्येक समूहमा n = 7): (i) PBS-उपचार गरिएको नकारात्मक नियन्त्रण समूह (PBS मात्र; gavage 100 μl/mous PBS त्यसपछि दैनिक intraperitoneal इंजेक्शन 100 μl/mouse PBS 3 घण्टा पछि)।7 दिनको लागि लगातार);(ii) नकारात्मक नियन्त्रण समूह MCC950 inhibitor [27] (PBS gavage मार्फत 100 μl/mouse, 3 घण्टा पछि, 10 mg/kg शरीरको वजन [BW] MCC950 [PBS मा] intraperitoneally दैनिक रूपमा प्रशासित गरिएको थियो, अवधि 7 दिन);(iii) G. duodenalis cyst संक्रमण समूह (1.5 x 106 cysts/mouse by gavage, 3 घण्टा पछि, 100 μl/mouse PBS intraperitoneally 7 दिनको लागि दैनिक प्रशासित);(iv) G. duodenalis cyst संयुक्त संक्रमण समूह MCC950 inhibitor उपचार समूह (1.5×106 cysts/mouse via gavage, 10mg/kg शरीरको वजन MCC950 intraperitoneally 7 दिनको लागि 3h मा दैनिक)।प्रत्येक मुसाको शरीरको तौल दैनिक अनुगमन गरिएको थियो र सबै मुसाहरू 7 औं दिनमा euthanized गरियो।फसल गरिएको ड्युओडेनम (३ सेन्टीमिटर लामो) लाई १ एमएल पीबीएसमा साना टुक्रामा काटियो, पीबीएसमा ४ डिग्री सेल्सियसमा सिस्टहरू रातारात नष्ट गरियो र जी. ड्युओडेनालिस ट्रोफोजोइट्स।ताजा ड्युओडेनम (१ सेमी लामो) हेमेटोक्सिलिन र इओसिन (H&E) दागको लागि अलग गरिएको थियो।
मुसाहरूलाई दुई समूहमा विभाजन गरिएको थियो: (i) MOCK नियन्त्रण समूह र (ii) MCC950 अवरोधक समूह।त्यहाँ प्रत्येक समूहमा पाँच उपचारहरू थिए (n = 7/उपचार समूह): (i) PBS उपचार नकारात्मक नियन्त्रण समूह (PBS मात्र; 100 μl/mous PBS, intramuscular (IM) इंजेक्शन (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) प्लाज्मिड नेगेटिभ कन्ट्रोल ग्रुप (100 µg/माउस डीएनए, इंट्रामस्कुलर इन्जेक्शन मार्फत); (iii) G. duodenalis सिस्ट इन्फेक्शन पोजिटिव कन्ट्रोल ग्रुप (1.5 x 106 cysts/mous, gavage मार्फत) (iv) a प्लाज्मिड pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 μg/mouse DNA, intramuscular injection द्वारा) र (v) प्लाज्मिड pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 µg/mouse) सँग उपचार गरिएको समूह DNA, १२ घण्टा बितिसकेपछि, MCC950 अवरोधक समूहका मुसाहरूले 7 दिनको लागि MCC950 (10 mg/kg शरीरको तौल) को दैनिक इन्ट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन प्राप्त गरे, जबकि MOCK समूहका मुसाहरूले PBS उपचारको बराबर मात्रा प्राप्त गरे। रक्त नमूनाहरू आँखाका मुसाहरूबाट सङ्कलन गरी 4 °C मा सीरम नमूनाहरू IL-1β स्तरहरूको मापन र इन्जाइम-लिङ्क्ड इम्युनोसर्बेन्ट एसे (ELISA) प्रयोग गरेर पृथक गरियो।
पैंतीस मुसाहरूलाई पाँच समूहमा विभाजन गरिएको थियो (n = 7/समूह)।समूह 1 पीबीएससँग उपचार गरिएको नकारात्मक नियन्त्रण समूह थियो: चूहोंले 100 μl पीबीएस इन्ट्रामस्क्युलर र 3 दिन पछि ग्याभेजद्वारा प्राप्त गर्यो।समूह 2 G. duodenalis cysts बाट संक्रमित भएको सकारात्मक नियन्त्रण समूह हो: मुसालाई 100 μl PBS को सुई लगाइयो, र 3 दिन पछि 1.5 x 106 सिस्ट/मुसालाई इन्ट्रागास्ट्रिक रूपमा इन्जेक्ट गरियो।तेस्रो समूह - ग्रहणी सिस्ट संक्रमणको लागि नियन्त्रण समूहसँग संयोजनमा pcDNA3.1(+) संग प्लाज्मिड प्रतिरक्षा: मुसाले 100 μg प्लाज्मिड DNA pcDNA3.1(+)(im) मौखिक रूपमा, 1.5×106 cysts/mouse 3 धेरैका लागि प्राप्त गर्यो। दिनहरू।समूह 4 र 5 पुन: संयोजक pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine plasmid or pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine प्लाज्मिड G. duodenalis cyst संक्रमणको संयोजनमा थिए।प्रायोगिक समूह: मुसाले pcDNA3 को 100 µg प्राप्त गरे।1(+)-giardine प्लाज्मिड DNA (im), त्यसपछि 3 दिन पछि, 1.5 × 106 cysts/mouse gavage मार्फत इन्जेक्ट गरियो।ट्यूब मार्फत G. duodenalis cyst को परिचय पछि प्रत्येक माउसको शरीरको वजन निगरानी गरिएको थियो।ताजा डुओडेनम परजीवी लोड मापन र एचई दाग विश्लेषणको लागि सङ्कलन गरिएको थियो।
हिस्टोपैथोलोजिकल परिवर्तनहरू पहिले प्रकाशित प्रक्रिया [30] अनुसार विश्लेषण गरिएको थियो।ताजा ड्युओडेनम टिस्यु सेल फिक्सेटिभसँग फिक्स गरिएको थियो, प्याराफिनमा इम्बेड गरिएको थियो, 4 μm खण्डहरूमा काटिएको थियो, H&E सँग दाग गरिएको थियो र हल्का माइक्रोस्कोप अन्तर्गत विश्लेषण गरिएको थियो।सात स्वतन्त्र मुसाहरूबाट सात टिश्यू खण्डहरूमा प्रतिनिधि रोगविज्ञान परिवर्तनहरू उपचारको बारेमा अनजान रोगविज्ञानी द्वारा मूल्याङ्कन गरियो र 200x म्याग्निफिकेसनमा कब्जा गरियो।भिल्लीको लम्बाइ र क्रिप्टको गहिराई पहिले वर्णन गरिएका विधिहरू अनुसार मापन गरिएको थियो।
भिट्रो र इन भिभोमा नतिजाहरू ट्रिपलिकेटमा प्राप्त गरियो।ग्राफप्याड प्रिज्म 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) को प्रयोग गरेर ग्राफहरू सिर्जना गरिएको थियो।दुई समूहहरू बीचको भिन्नताहरू t-test द्वारा विश्लेषण गरिएको थियो, जबकि ≥3 समूहहरू बीचको भिन्नताहरू SPSS सफ्टवेयर (संस्करण 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA) को प्रयोग गरेर भिन्नताको एकतर्फी विश्लेषण (ANOVA) द्वारा विश्लेषण गरिएको थियो।लेभेनको परीक्षण र बोनफेरोनीको पोस्ट हक परीक्षण (बी) को प्रयोग गरेर भिन्नताको एकरूपताका लागि डाटा विश्लेषण गरियो।महत्व P <0.05, P <0.01, र P <0.001 (महत्वपूर्ण [ns]) (P>0.05) को रूपमा व्यक्त गरिएको छ।
क्योटो इन्साइक्लोपीडिया अफ जिन्स एन्ड जेनोम्स (KEGG) मा GEV प्रोटियोमिक्सको हाम्रो अघिल्लो विश्लेषणले देखाएको छ कि धेरै लक्ष्यहरू भडकाऊ संकेत मार्गहरूको सक्रियतामा संलग्न हुन सक्छन् [१३]।हामीले दुई आशाजनक लक्ष्यहरू, alpha-2 र alpha-7.3 giardins चयन गर्यौं, यी अणुहरूलाई विस्तार गर्नुहोस् र pcDNA3.1(+) युकेरियोटिक अभिव्यक्ति भेक्टर निर्माण गर्न प्रयोग गर्नुहोस्।अनुक्रमण पछि, पुन: संयोजक pcDNA3.1(+)-alpha-2 र alpha-7.3 giardine अभिव्यक्ति प्लाज्मिडहरू प्राथमिक माउस peritoneal macrophages मा रूपान्तरण गरियो, र सूजनको caspase-1 p20 हस्ताक्षर प्रोटीन (सक्रिय क्यास्पेस-1 को एक टुक्रा) पहिचान गरियो। मुख्य अणुहरू स्पष्ट पार्ने रूपमा जसले सूजन ट्रिगर गर्न सक्छ।परिणामहरूले देखाए कि अल्फा-2 र अल्फा-7.3 giardines GEV जस्तै p20 क्यास्पेस-1 अभिव्यक्ति प्रेरित गर्न सक्छ।उपचार नगरिएको नकारात्मक नियन्त्रण (PBS मात्र) र प्लाज्मिड नियन्त्रण pcDNA3.1(+) (चित्र 1) मा क्यास्पेस-1 सक्रियतामा कुनै प्रभाव फेला परेन।
pcDNA3.1(+)-alpha-2 र alpha-7.3 giardins द्वारा p20 क्यास्पेस-1 सक्रियताको मापन।पुन: संयोजक युकेरियोटिक अभिव्यक्ति प्लाज्मिडहरू pcDNA3.1(+)-alpha-2 र alpha-7.3 giardines (प्रत्येक लेन माथि) प्राथमिक माउस पेरिटोनियल म्याक्रोफेजहरूमा रूपान्तरण गरियो र कल्चर सुपरनेटेन्टहरू 24 घण्टा पछि काटियो।सिग्नेचर क्यास्पेस-१ p20 इन्फ्लामासोम प्रोटीनको अभिव्यक्ति स्तरहरू मापन गर्न पश्चिमी ब्लटिंग प्रयोग गरिएको थियो।PBS-मात्र उपचार समूह (लेन C) र pcDNA3.1 (+) मोनोथेरापी समूह (pcDNA3.1 लेन) नकारात्मक नियन्त्रणको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो, र GEV उपचार समूहलाई सकारात्मक नियन्त्रणको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो।पुन: संयोजक प्रोटीनको अभिव्यक्ति प्रत्येक प्रोटीनमा हिस्टिडाइन ट्याग पत्ता लगाएर पुष्टि गरिएको थियो, र अपेक्षित प्रोटीन ब्यान्डहरू अल्फा-2 giardine (38.2 kDa) र alpha-7.3 giardine (37.2 kDa) थिए।GEV, Giardia duodenum extracellular vesicles, pcDNA3.1(+), EcoRV- linearized vector, SUP, supernatant
alpha-2 giardine र alpha-7.3 giardine ले p20 caspase-1 अभिव्यक्ति प्रेरित गर्छ र होस्ट NLRP3 भडकाऊ प्रतिक्रिया सक्रिय गर्न भूमिका खेल्छ कि भनेर निर्धारण गर्न, pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine र pcDNA3.1(+)-alpha -7.3 जिआर्डिनलाई पुन: संयोजक प्लाज्मिड डीएनएको साथ प्राथमिक माउस पेरिटोनियल म्याक्रोफेजहरूमा रूपान्तरण गरिएको थियो, र अभिव्यक्तिको स्तर, स्थानीयकरण, र कुञ्जी इन्फ्लेमेटरी प्रोटीन NLRP3 को ओलिगोमेराइजेशन निर्धारण गरिएको थियो।यस प्रयोगमा, GEV सकारात्मक नियन्त्रण समूहको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो, र कुनै उपचार समूह (PBS मात्र) वा pcDNA3.1(+) ट्रान्सफेक्सन उपचार समूह नकारात्मक समूह थियो।परिणामहरूले देखाए कि, GEV समूहमा जस्तै, giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 र giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 को पुनः संयोजक प्लाज्मिड DNA ले NLRP3, प्रो-IL-1β र procaspase-1 र caspase-1 सक्रियता (चित्र 2a)।थप रूपमा, दुबै जिआर्डिनहरूले महत्त्वपूर्ण IL-1β स्राव (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000; alpha-2 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.007 लाई प्रेरित गरे। )।;alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P<0.0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0047) (चित्र 2b)।धेरै जसो ASC प्रोटिनहरू नो-ट्रीटमेन्ट समूहमा वा pcDNA3.1(+) प्लाज्मिडबाट ट्रान्सफेक्ट गरिएको उपचार समूहमा pcDNA3.1(+)-alpha-2 वा pcDNA3.1(+)-alpha-को विपरित मोनोमेरिक थिए। 7.3 giardine।ASC oligomerization GEV सकारात्मक नियन्त्रण समूह वा समूहको पुन: संयोजक प्लाज्मिड DNA मा भयो, एक ओलिगोमेरिक फारम (चित्र 2c) देखाउँदै।यी प्रारम्भिक डेटाले सुझाव दिन्छ कि अल्फा-2 giardine र अल्फा-7,3 giardine NLRP3 सूजन सक्रियता प्रेरित गर्न सक्छ।ASC र NLRP3 को स्थानीयकरणको पछिल्ला इम्युनोफ्लोरोसेन्ट अध्ययनहरूले देखायो कि नकारात्मक नियन्त्रण समूहमा, ASC प्रोटीन साइटोप्लाज्ममा छरिएको थियो र giardine वा pcDNA3 सँग pcDNA3.1(+)-alpha-2 को उत्तेजनामा ​​डट सिग्नलको रूपमा देखा पर्‍यो।1(+)-alpha-7,3 giardine समूह वा GEV सकारात्मक नियन्त्रण समूह (चित्र 2d)।नकारात्मक नियन्त्रण र प्लाज्मिड-उपचार pcDNA 3.1 समूहहरूमा, NLRP3 प्रोटीन संकेत पत्ता लागेन, जबकि pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine वा pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 को प्रतिक्रियामा फ्लोरोसेन्ट सिग्नल डट। पत्ता लागेको थियो।।giardine साइटोप्लाज्म वा HEV को उत्तेजना मा पाइन्छ (चित्र 2e)।यी तथ्याङ्कहरूले G. duodenalis giardin alpha-2 र giardin alpha-7.3 ले माउस प्राथमिक पेरिटोनियल म्याक्रोफेजहरूमा NLRP3 इन्फ्लामासोम सक्रिय पार्छ भनेर देखाउँछ।
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin र pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin ले माउस peritoneal macrophages मा NLRP3 inflammasome सक्रिय गर्दछ।पुन: संयोजक युकेरियोटिक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin र pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin लाई प्राथमिक मुरिन पेरिटोनियल म्याक्रोफेज र कोशिकाहरूमा स्थानान्तरण गर्नुहोस्, वा अभिव्यक्तिको विश्लेषणको लागि 24 घन्टा भित्र सुपरनेटेन्ट फसल गर्नुहोस्, oligomerization। , स्राव।र प्रमुख भडकाऊ प्रोटीन को स्थानीयकरण।PBS-मात्र (C) समूह र pcDNA3.1 (+) एकल उपचार समूह नकारात्मक नियन्त्रणको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो, र GEV उपचार समूह सकारात्मक समूहको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो।NLRP3, प्रो-IL-1β, प्रो-क्यास्पेस-1, र p20 क्यास्पेस-1 सहित एक प्रमुख इन्फ्लेमेटरी प्रोटीन NLRP3, पश्चिमी ब्लोटिंग द्वारा पत्ता लगाइयो।b supernatants मा IL-1β को स्राव को स्तर इन्जाइम-लिंक्ड इम्युनोसोर्बेन्ट परख (ELISA) को प्रयोग गरेर निर्धारण गरिएको थियो।नियन्त्रण र प्रयोगात्मक समूहहरू बीचको भिन्नताहरू SPSS सफ्टवेयर संस्करण 22.0 प्रयोग गरेर भिन्नता (ANOVA) को एक-तर्फी विश्लेषणद्वारा विश्लेषण गरिएको थियो।तारा चिन्हहरूले समूहहरू **P<0.01 र ***P<0.001 बीचको महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू संकेत गर्दछ।c गोलीहरूमा ASC oligomerization स्तरहरू DSS क्रस-लिङ्किङ विश्लेषणद्वारा निर्धारण गरिएको थियो, जबकि सेल lysates मा ASC स्तरहरू लोडिङ नियन्त्रणको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो।d immunofluorescence प्रयोग ISC स्थानीयकरण को दृश्य।e Immunofluorescence NLRP3 को स्थानीयकरण कल्पना गर्न प्रयोग गरिएको थियो।ASC, apoptotic स्पेक-जस्तो प्रोटीन;IL, interleukin;NLRP3, न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग oligomerization-like रिसेप्टर 3;ns, महत्त्वपूर्ण छैन (P > 0.05)
दुबै G. duodenalis र GEVs ले निस्कन्छ NLRP3 इन्फ्लामासोम सक्रिय गर्दछ र भिट्रोमा होस्ट भडकाउने प्रतिक्रियाहरूलाई विनियमित गर्दछ।यसरी, G. duodenalis को pathogenicity मा NLRP3 inflammasome को भूमिका अस्पष्ट रहन्छ।यस मुद्दाको अनुसन्धान गर्न, हामीले G. duodenalis cyst बाट संक्रमित मुसाहरू र G. duodenalis cyst + MCC950 inhibitor उपचारबाट संक्रमित मुसाहरू बीचको प्रयोग डिजाइन गर्यौं र G. duodenalis cyst सँग संक्रमित हुँदा NLRP3 इन्फ्लामासोम अभिव्यक्तिलाई तुलना गर्‍यौं।प्रयोगको विस्तृत योजना चित्र 3a मा देखाइएको छ।विभिन्न उपचार समूहहरूमा मुसाको शरीरको तौलमा हुने परिवर्तनलाई सिस्टको संक्रमण पछि ७ दिनसम्म अनुगमन गरिएको थियो र परिणामहरू चित्र ३b मा देखाइएको छ।शुद्ध PBS संग उपचार गरिएको समूहको तुलनामा, परिणामहरूले देखायो कि (i) G. duodenalis cyst बाट संक्रमित मुसाको शरीरको तौल संक्रमण पछि 3 दिन देखि 7 दिन सम्म घट्यो;(ii) MCC950 अवरोधकसँगको उपचारले मुसाको शरीरको तौलमा कुनै महत्त्वपूर्ण प्रभाव पारेन।।एकल संक्रमण समूहको तुलनामा, MCC950 सँग उपचार गरिएको ग्रहणी संक्रमण समूहको BW फरक-फरक डिग्रीमा घट्यो (दिन 1: ANOVA, F(3, 24) = 1.885, P = 0.0148; दिन 2: ANOVA, F( 3, 24) ) = ०.००१ (३, २४)=०.६४९७, P=०.०६४५; दिन ६: ANOVA, F(3, 24)=5.457, P=0.0175; ANOVA, F(3, 24) = 2.893, P = 0.0202)।यी डाटाहरूले देखाउँछन् कि NLRP3 इन्फ्लामासोमले मुसाहरूलाई ग्रहणी संक्रमणको प्रारम्भिक चरणहरूमा (2-4 दिन) महत्त्वपूर्ण वजन घटाउनबाट बचाउँछ।हामीले त्यसपछि ड्युओडेनल लभेज फ्लुइडमा G. duodenalis trophozoites पत्ता लगाउने लक्ष्य राख्यौं र परिणामहरू चित्र 3c मा देखाइएको छ।G. duodenalis सिस्ट संक्रमण समूहको तुलनामा, NLRP3 इन्फ्लामासोम (t(12) = 2.902, P = 0.0133) लाई अवरुद्ध गरेपछि ड्युओडेनममा ट्रोफोजोइट्सको संख्या उल्लेखनीय रूपमा बढेको छ।PBS र MCC950 सँग मात्र उपचार गरिएको नकारात्मक नियन्त्रणको तुलनामा HE सँग दाग भएको डुओडेनल टिस्युहरूले देखायो: (i) G. duodenalis cyst संक्रमणले डुओडेनल भिल्ली (ANOVA, F(3, 24) = 0.4903, P= 0.0488 लाई क्षति पुर्‍यायो। ) र क्रिप्ट एट्रोफी (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0.0089);(ii) G. duodenalis cysts बाट संक्रमित मुसाबाट डुओडेनम र MCC950 inhibitors बाट उपचार गरियो।ड्युओडेनल भिल्ली क्षतिग्रस्त र मृत (ANOVA, F(3, 24) = 0.4903, P = 0.0144) एट्रोफी र क्रिप्ट शाखाको साथ (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0, 0481) (चित्र 3d- f)।यी परिणामहरूले सुझाव दिन्छ कि NLRP3 इन्फ्लामासोमले G. duodenalis को रोगजनकता कम गर्न भूमिका खेल्छ।
Giardia duodenum संक्रमण मा NLRP3 inflammasome को भूमिका।मुसाहरू (iv) ड्युओडेनोकोकल सिस्टहरूद्वारा गाभियो र त्यसपछि MCC950 (ip) सँग वा बिना उपचार गरियो।PBS वा MCC950 सँग एकल उपचार समूहहरू नियन्त्रणको रूपमा प्रयोग गरियो।प्रयोगात्मक समूह र उपचार पद्धति।b प्रत्येक विभिन्न उपचार समूहमा मुसाको शरीरको तौल ७ दिनसम्म अनुगमन गरिएको थियो।G. duodenalis संक्रमण समूह र G. duodenalis + MCC950 संक्रमण उपचार समूह बीचको भिन्नता SPSS सफ्टवेयर संस्करण 22.0 को प्रयोग गरेर t-test द्वारा विश्लेषण गरिएको थियो।तारा चिन्हहरूले *P<0.05, **P<0.01, वा ***P<0.001 मा महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू संकेत गर्दछ।c परजीवी लोड ड्युओडेनल लभेज फ्लुइडमा ट्रोफोजोइट्सको संख्या गणना गरेर निर्धारण गरिएको थियो।G. duodenalis संक्रमण समूह र G. duodenalis + MCC950 संक्रमण उपचार समूह बीचको भिन्नता SPSS सफ्टवेयर संस्करण 22.0 को प्रयोग गरेर t-test द्वारा विश्लेषण गरिएको थियो।तारा चिन्हहरूले *P <0.05 मा महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू संकेत गर्दछ।d Hematoxylin र eosin (H&E) ड्युओडेनल हिस्टोपैथोलोजीको दाग नतिजा।रातो तीरहरूले भिल्लीमा भएको क्षतिलाई संकेत गर्दछ, हरियो तीरहरूले क्रिप्टहरूमा क्षतिको संकेत गर्दछ।स्केल बार: 100 माइक्रोन।e, f ड्युओडेनल भिलस उचाइ र माउस क्रिप्ट उचाइको सांख्यिकीय विश्लेषण।तारा चिन्हहरूले *P<0.05 र **P<0.01 मा महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू संकेत गर्दछ।परिणामहरू 7 स्वतन्त्र जैविक प्रयोगहरूबाट लिइएको हो।BW, शरीरको वजन;ig, intragastric वितरण मार्ग;ip, intraperitoneal वितरण मार्ग;ns, महत्त्वपूर्ण छैन (P > 0.05);पीबीएस, फस्फेट बफर खारा;WT, जंगली प्रकार
IL-1β को स्राव सूजन सक्रियता को एक विशेषता हो।G. duodenalis alpha-2 giardine र alpha-7.3 giardine ले Vivo मा NLRP3 होस्ट इन्फ्लामासोम सक्रिय गर्दछ कि भनेर निर्धारण गर्न, हामीले उपचार नगरिएको WT माइस (Sham Group) र NLRP3 inflammasome-blocked mice (MCC950 inhibited treatment group) प्रयोग गर्यौं।प्रयोगको विस्तृत योजना चित्र 4a मा देखाइएको छ।प्रायोगिक समूहहरूमा PBS, G. duodenalis cyst को gavage द्वारा उपचार, pcDNA3.1 को इन्ट्रामस्कुलर इन्जेक्सन, र pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine वा pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine को इन्ट्रामस्कुलर इन्जेक्सनद्वारा उपचार गरिएको मुसाहरू समावेश थिए।पुन: संयोजक प्लाज्मिडको इन्ट्रामस्कुलर प्रशासन पछि 7 औं दिनमा, सीरम सङ्कलन गरिएको थियो र प्रत्येक समूहमा IL-1β को स्तर निर्धारण गरिएको थियो।चित्र 4b मा देखाइए अनुसार, MOCK समूहमा: (i) PBS समूहको तुलनामा, pcDNA3.1 उपचारले IL-1β स्राव (ANOVA, F(4.29) = 4.062, P = 0.9998) मा कुनै महत्त्वपूर्ण प्रभाव पारेन, तथापि, IL-β स्राव G. duodenalis सिस्ट समूह (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine र pcDNA3 मा उल्लेखनीय रूपमा बढेको थियो।1- अल्फा-7.3 जिआर्डिनको इन्ट्रामस्कुलर इन्जेक्सनले सीरम IL-1β स्तरहरूमा उल्लेखनीय वृद्धि गर्‍यो (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P<0.0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine प्रेरित IL-1β स्रावको उच्च स्तर pcDNA3.1-alpha-2 giardine intramuscular injection group (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0333) मा। ।MCC950 उपचार समूह र MOCK समूहमा प्रत्येक समूहको तुलनामा: (i) PBS नियन्त्रण समूह र pcDNA3.1 नियन्त्रण समूहमा IL-1β स्राव स्तरहरू MCC950 अवरोधकलाई रोकेपछि एक निश्चित हदसम्म घट्यो, तर भिन्नता थिएन। महत्त्वपूर्ण (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) MCC950 अवरुद्ध गरेपछि।, IL-1β स्राव G. duodenalis सिस्ट-संक्रमित समूह, pcDNA3.1-alpha-2 giardine समूह, र pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine समूह (G. duodenalis: ANOVA, F(9) मा उल्लेखनीय रूपमा कम भएको थियो। . ) = ३.५४०, P = ०.०१६४)।यी परिणामहरूले सुझाव दिन्छ कि alpha-2 giardine र alpha-7.3 giardine vivo मा NLRP3 inflammasome को सक्रियता मध्यस्थता गर्दछ।
pcDNA3.1(+)-giardines ले vivo मा NLRP3 होस्ट इन्फ्लामासोम सक्रिय गर्दछ।मुसाहरूलाई पुन: संयोजक युकेरियोटिक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine वा pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine सँग खोप (IM) लगाइयो र त्यसपछि MCC950 (ip; MCC950 समूह) वा होइन (डमी समूह) मार्फत उपचार गरियो। )।PBS वा pcDNA3.1(+) प्लाज्मिड उपचार समूहलाई नकारात्मक नियन्त्रणको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो, G. duodenalis सिस्ट उपचार समूहलाई सकारात्मक नियन्त्रणको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो।प्रयोगात्मक समूह र उपचार पद्धति।b मुसाहरूमा IL-1β को सीरम स्तरहरू 7 दिनमा ELISA परख द्वारा मापन गरियो।MOCK समूहका समूहहरू बीचको भिन्नताहरू एकतर्फी ANOVA प्रयोग गरेर विश्लेषण गरियो, र SPSS सफ्टवेयर संस्करण 22.0 को t-परीक्षण प्रयोग गरेर MOCK समूह र MCC950 समूह बीचको भिन्नताहरू विश्लेषण गरियो।ताराहरूले MOCK समूह, *P<0.05 र ***P<0.001; मा उपचार समूहहरू बीच महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू संकेत गर्दछ;डलर चिन्हहरू ($) ले MOCK समूह र P <0.05 मा MCC950 समूहमा प्रत्येक समूह बीचको महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरूलाई संकेत गर्दछ।सात स्वतन्त्र जैविक प्रयोगहरूको नतिजा।i, इंट्रामस्कुलर इंजेक्शन, ns, महत्त्वपूर्ण छैन (P > 0.05)
G. duodenalis infectivity मा NLRP3 होस्ट inflammasome को alpha-2 र alpha-7.3 giardine-mediated सक्रियताको प्रभावको अनुसन्धान गर्न, हामीले WT C57BL/6 माइस प्रयोग गर्यौं र अल्फा-2 giardine र alpha-7.3 giardine इन्जेक्ट गर्यौं।G. duodenalis cyst को ग्यास्ट्रिक ट्यूब मार्फत 3 दिन पछि, इन्ट्रामस्क्युलर रूपमा प्लाज्मिडलाई इन्जेक्सन गरियो, त्यसपछि मुसाहरूलाई 7 दिनसम्म अवलोकन गरियो।प्रयोगको विस्तृत योजना चित्र 5a मा देखाइएको छ।प्रत्येक माउसको शरीरको तौल हरेक दिन मापन गरिएको थियो, ग्यास्ट्रिक ट्यूब मार्फत प्रशासन पछि 7 औं दिनमा ताजा ग्रहणी ऊतकको नमूनाहरू सङ्कलन गरिएको थियो, ट्रोफोजोइट्सको संख्या मापन गरिएको थियो, र हिस्टोपाथोलोजिकल परिवर्तनहरू अवलोकन गरियो।चित्र 5b मा देखाइए अनुसार, खुवाउने समय बढ्दै जाँदा, प्रत्येक समूहमा बिस्तारै मुसाहरूको BW बढ्दै गयो।G. duodenalis cysts को intragastric प्रशासन पछि तेस्रो दिनमा मुसाको MT कम हुन थाल्यो, र त्यसपछि बिस्तारै बढ्यो।अल्फा-२ जिआर्डिन र अल्फा७.३ जिआर्डिनको इन्ट्रामस्कुलर इन्जेक्सनद्वारा प्रेरित एनएलआरपी३ इन्फ्लामासोमको सक्रियताले मुसामा तौल घटाउन निकै कम गर्छ (दिन १: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1.39 = ०.९७५४ दिन १: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 दिन 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = ०.३१७२, P = ०.९९७९; दिन २: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.8409; दिन 3: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, F 4, 30) = 0.8222, P = 0.0262 दिन 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4 , 30) = 0.8222, P = 0.0083 दिन 4: pcDNA3.1-alpha-NOgiard, , F(4, 30) = 0.5620, P = 0.0012, दिन 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5620, P <0.0001, दिन 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 दिन 5: pcDNA3.1-alpha -7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 दिन 6: pcDNA alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0012, दिन 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;दिन 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 दिन 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4 , 30) = 0.5369, P <0.0001)।परजीवी लोड ड्युओडेनम (चित्र 5c) मा मूल्याङ्कन गरिएको थियो।उपचार नगरिएको सकारात्मक नियन्त्रण र खाली pcDNA3.1 भेक्टरको साथ सुई लगाएको समूहको तुलनामा, α-2 giardine र α-7,3 giardine (pcDNA3.1-alpha) सँग इन्जेक्ट गरिएका समूहहरूमा G. duodenalis trophozoites को संख्या उल्लेखनीय रूपमा घटेको थियो। -2 giardine : ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P<0.0001)।थप रूपमा, giardine alfa-7.3 giardine alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0081) भन्दा मुसाहरूमा बढी सुरक्षात्मक थियो।एचई दागको नतिजा चित्रमा देखाइएको छ।5d-f।Alpha-2 giardine र alpha-7.3 giardine सँग इन्जेक्सन गरिएका मुसाहरूमा G. duodenalis र G. duodenalis सँग इन्जेक्सन गरिएको मुसालाई खाली pcDNA3 भेक्टर .1 Zoom .1 Zoom सँग इन्जेक्सन गरिएको मुसाको तुलनामा, भिलस क्षतिबाट प्रकट भएको ग्रहणी तन्तुका घाउहरू कम थिए।(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 or P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, = 0.0028 वा P = 0.0055) र घटाइएको क्रिप्ट एट्रोफी (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 वा P = 0.0158; pcDNA3.1-alpha-2 giardine , F(3, 24) = 1.470, P = 0.0371 वा P = 0.0191)।यी परिणामहरूले सुझाव दिन्छ कि alpha-2 giardine र alpha-7,3 giardine ले Vivo मा NLRP3 inflammasome सक्रिय गरेर G. duodenalis को संक्रामकता कम गर्छ।
G. duodenalis संक्रमणमा pcDNA3.1(+)-giardins को भूमिका।मुसाहरूलाई पुन: संयोजक युकेरियोटिक अभिव्यक्ति प्लाज्मिडहरू pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine वा pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine सँग खोप (IM) लगाइयो र त्यसपछि G. duodenalis cysts (ig) सँग चुनौती दिइयो।PBS समूह र pcDNA3.1(+) + ड्युओडेनल सिस्ट उपचार समूहलाई नकारात्मक नियन्त्रण समूहको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो, र ग्रहणी सिस्ट उपचार समूहलाई सकारात्मक नियन्त्रण समूहको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो।प्रयोगात्मक समूह र उपचार पद्धति।b प्रत्येक विभिन्न उपचार समूहहरूमा मुसाहरूको एमटीलाई चुनौती पछि 7 दिनको लागि अनुगमन गरिएको थियो।तारा चिन्हहरूले G. duodenalis समूह र pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine समूह, *P <0.05, **P <0.01, र ***P <0.001;डलर चिन्ह ($) ले G. duodenalis को प्रत्येक समूह र pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine समूह, $$P<0.01 र $$$P<0.001 बीचको महत्त्वपूर्ण भिन्नतालाई जनाउँछ।c परजीवी लोड ड्युओडेनम (3 सेमी लामो) बाट 1 मिलीलीटर ड्युओडेनल लभेजमा ट्रोफोजोइट्सको संख्या गणना गरेर निर्धारण गरिएको थियो र ड्युओडेनमको प्रति सेन्टीमिटर परजीवीको संख्याको रूपमा व्यक्त गरिएको थियो।G. duodenalis संक्रमण समूह, pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine समूह, र pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine समूह बीचको भिन्नताहरू SPSS सफ्टवेयर संस्करण 22.0 प्रयोग गरेर एकतर्फी ANOVA द्वारा विश्लेषण गरिएको थियो।तारा चिन्हहरूले **P <0.01 र ***P <0.001 मा महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू संकेत गर्दछ।d ग्रहणीमा हिस्टोपैथोलोजिकल परिवर्तनहरू।रातो तीरहरूले भिल्लीमा भएको क्षतिलाई संकेत गर्दछ, हरियो तीरहरूले क्रिप्टहरूमा क्षतिको संकेत गर्दछ।स्केल बार: 100 माइक्रोन।e, f माउस ड्युओडेनल भिलस उचाइ (e) र क्रिप्ट उचाइ (f) को सांख्यिकीय विश्लेषण।चित्र 1d मा समूहहरू बीचको भिन्नताहरू SPSS सफ्टवेयर संस्करण 22.0 प्रयोग गरेर एकतर्फी ANOVA द्वारा विश्लेषण गरिएको थियो।तारा चिन्हहरूले *P<0.05 र **P<0.01 मा महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू संकेत गर्दछ।सात स्वतन्त्र जैविक प्रयोगहरूको नतिजा।ns, महत्त्वपूर्ण छैन (P > 0.05)
Giardia duodenum मानव र अन्य स्तनधारी जनावरहरूको एक प्रसिद्ध आन्द्रा परजीवी हो जसले giardiasis निम्त्याउँछ।2004 मा, यसलाई 6 वर्ष भन्दा बढी, विशेष गरी निम्न सामाजिक आर्थिक स्थिति भएका समुदायहरूमा उच्च व्यापकताका कारण WHO उपेक्षित रोगहरूको पहलमा समावेश गरिएको थियो [32]।जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणालीले G. duodenalis संक्रमणको प्रतिरक्षा प्रतिक्रियामा महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छ।माउस म्याक्रोफेजहरूले एक्स्ट्रासेलुलर जालहरू [३३] छोडेर G. ड्युओडेनलिसलाई निम्त्याउने र मार्ने रिपोर्ट गरिएको छ।हाम्रो अघिल्लो अध्ययनहरूले देखाएको छ कि G. duodenalis, एक गैर-आक्रामक एक्स्ट्रासेल्युलर परजीवी, p38 MAPK, ERK, NF-κB p65, र NLRP3 इन्फ्लेमेटरी सिग्नलिंग मार्गहरूलाई माउस म्याक्रोफेजहरूमा होस्ट भडकाऊ प्रतिक्रियाहरू विनियमित गर्न सक्रिय गर्दछ, र जारी गरिएको GEV ले यस प्रक्रियालाई बढाउन सक्छ।१३], २४]।यद्यपि, GEV मा NLRP3 इन्फ्लामासोम-नियन्त्रित सूजन र giardiasis मा NLRP3 इन्फ्लामासोमको भूमिकामा संलग्न सटीक PAMPs स्पष्ट हुन बाँकी छ।यी दुई प्रश्नहरूमा प्रकाश पार्न, हामीले यो अध्ययन सञ्चालन गरेका छौं।
NLRP3 इन्फ्लामासोम प्रतिरक्षा कोशिकाहरूको साइटोप्लाज्ममा अवस्थित छ र विभिन्न कणहरू जस्तै यूरिक एसिड क्रिस्टल, विषाक्त पदार्थ, ब्याक्टेरिया, भाइरस र परजीवीहरू द्वारा सक्रिय हुन सक्छ।ब्याक्टेरियल अध्ययनहरूमा, विषाक्त पदार्थहरूलाई प्रमुख PAMPs को रूपमा पहिचान गरिएको छ जसले भडकाऊ सेन्सरहरू सक्रिय गर्दछ, जसले सूजन र सेल मृत्यु [34] को नेतृत्व गर्दछ।केही संरचनात्मक रूपमा विविध विषाक्त पदार्थहरू, जस्तै स्टेफिलोकोकस ओरियस [३५] र एस्चेरिचिया कोलाई [३६] बाट हेमोलाइसिन, एन्टरोटोक्सिन (NHE) [३७] बाट हेमोलिसिन बीएल (एचबीएल), एनएलआरपी३ सूजनको सक्रियतालाई प्रेरित गर्दछ।भाइरल अध्ययनहरूले देखाएको छ कि SARS-COV-2 लिफाफा (E) प्रोटीन [38] र Zika भाइरस NS5 प्रोटीन [39] जस्ता वायरलन्स प्रोटीनहरू NLRP3 रिसेप्टर द्वारा मान्यता प्राप्त महत्त्वपूर्ण PAMPs हुन्।परजीवी अध्ययनहरूमा, धेरै परजीवीहरू टोक्सोप्लाज्मा गोन्डी, ट्राइकोमोनास योनिलिस [४०], ट्रिपोनोसोमा क्रुजी [४१], र लीशमानिया [४२] जस्ता होस्ट इन्फ्लामासोम सक्रियतासँग सम्बन्धित रहेको रिपोर्ट गरिएको छ।Toxoplasma gondii को virulence संग सम्बन्धित घने ग्रेन्युल प्रोटीन GRA35, GRA42, र GRA43, लुईस मुसा म्याक्रोफेज [43] मा पाइरोप्टोसिस को प्रेरण को लागी आवश्यक छ।थप रूपमा, केही लीशमानिया अध्ययनहरूले NLRP3 इन्फ्लामासोममा संलग्न व्यक्तिगत अणुहरूमा ध्यान केन्द्रित गरेको छ, जस्तै परजीवी झिल्ली लिपोफोस्फोग्लिकन [४४] वा जस्ता मेटालोप्रोटेज [४५]।जीनहरूको एनेक्सिन-जस्तो अल्फा-गियार्डिन परिवारमा, अल्फा-१ जियार्डिनलाई माउसको मोडेलमा G. ड्युओडेनालिस विरुद्ध सुरक्षा प्रदान गर्ने सम्भावित खोप उम्मेद्वारको रूपमा देखाइएको छ [१८]।हाम्रो अध्ययनमा, हामीले G. duodenalis virulence factors alpha-2 र alpha-7,3 giardines छनोट गर्यौं, जुन giardia को लागि अद्वितीय तर अपेक्षाकृत कम रिपोर्ट गरिएको छ।यी दुई लक्ष्य जीनहरूलाई pcDNA3.1(+) युकेरियोटिक अभिव्यक्ति प्रणाली भेक्टरमा सूजन सक्रियताको विश्लेषणको लागि क्लोन गरिएको थियो।
हाम्रो माउस मोडेलमा, क्लीभ्ड क्यास्पेस टुक्राहरूले भडकाऊ सक्रियताको मार्करको रूपमा काम गर्दछ।उत्तेजित भएपछि, NLRP3 ले ASC सँग अन्तरक्रिया गर्छ, प्रोकास्पेसहरू भर्ती गर्दछ, र सक्रिय क्यास्पेसहरू उत्पन्न गर्दछ जसले प्रो-IL-1β र प्रो-IL-18 लाई क्रमशः परिपक्व IL-1β र IL-18 मा क्लिभ गर्छ -18।इन्फ्लेमेटरी क्यास्पेसेस (क्यास्पेस -1, -4, -5 र -11) सिस्टीन प्रोटीजहरूको एक संरक्षित परिवार हो जुन जन्मजात रक्षाको लागि महत्वपूर्ण हुन्छ र सूजन र प्रोग्राम गरिएको सेल मृत्यु [46] मा संलग्न हुन्छ।क्यास्पेस-1 क्यानोनिकल इन्फ्लामासोमहरू [47] द्वारा सक्रिय हुन्छ, जबकि क्यास्पेस-4, -5, र -11 एटिपिकल इन्फ्लामासोमहरू [48] को गठनको क्रममा क्लीभ हुन्छन्।यस अध्ययनमा, हामीले माउस पेरिटोनियल म्याक्रोफेजहरू मोडेलको रूपमा प्रयोग गर्यौं र G. duodenalis संक्रमणको अध्ययनमा होस्ट NLRP3 सूजन सक्रियताको मार्करको रूपमा p20 caspase-1 cleaved caspase-1 को अनुसन्धान गर्‍यौं।नतिजाहरूले देखाए कि धेरै अल्फा-जियार्डिनहरू सूजनको विशिष्ट सक्रियताको लागि जिम्मेवार छन्, जुन ब्याक्टेरिया र भाइरसहरूमा संलग्न मुख्य विषाणु अणुहरूको खोजसँग मेल खान्छ।यद्यपि, हाम्रो अध्ययन केवल प्रारम्भिक स्क्रिन हो र त्यहाँ अन्य अणुहरू छन् जसले गैर-शास्त्रीय इन्फ्लामासोमहरू सक्रिय गर्न सक्छन्, किनकि हाम्रो अघिल्लो अध्ययनले G. duodenalis संक्रमण [13] मा शास्त्रीय र गैर-शास्त्रीय इन्फ्लामासोमहरू फेला पारेको थियो।उत्पन्न p20 क्यास्पेस-1 NLRP3 इन्फ्लामासोमसँग सम्बन्धित छ कि छैन भनेर थप निर्धारण गर्न, हामीले अल्फा-2 र अल्फा-7.3 giardins लाई माउस पेरिटोनियल म्याक्रोफेजहरूमा मुख्य अणु प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तरहरू र ASC oligomerization स्तरहरू निर्धारण गर्नको लागि स्थानान्तरण गर्‍यौं, दुबै α-giardins सक्रिय भएको पुष्टि गर्दै। ज्वलनशील NLRP3।हाम्रा नतिजाहरू Manko-Prykhoda et al. को भन्दा अलि फरक छन्, जसले रिपोर्ट गरे कि G. muris वा E. coli EPEC स्ट्रेनको साथ Caco-2 कोषहरूको उत्तेजनाले मात्र NLRP3, ASC, र caspase-1 को फ्लोरोसेन्स तीव्रता बढाउन सक्छ। यद्यपि महत्त्वपूर्ण रूपमा होइन, जबकि G. muris र E. coli को लागत कसरी तीन प्रोटीनको स्तर बढ्यो [49]।यो विसंगति Giardia प्रजातिहरू, सेल लाइनहरू, र प्राथमिक कक्षहरूको चयनमा भिन्नताहरूको कारण हुन सक्छ।हामीले MCC950 प्रयोग गरेर 5-हप्ता पुरानो महिला WT C57BL/6 मुसामा भिभो एसेमा पनि प्रदर्शन गर्यौं, जुन G. duodenalis लाई बढी संवेदनशील हुन्छ।MCC950 एक शक्तिशाली र चयनात्मक सानो अणु NLRP3 अवरोधक हो जसले न्यानोमोलर सांद्रतामा क्यानोनिकल र गैर-क्यानोनिकल NLRP3 सक्रियतालाई रोक्छ।MCC950 ले NLRP3 सक्रियतालाई रोक्छ तर AIM2, NLRC4, र NLRP1 भडकाऊ मार्गहरू वा TLR संकेत गर्ने मार्गहरू [27] को सक्रियतालाई असर गर्दैन।MCC950 ले NLRP3 सक्रियतालाई रोक्छ तर NLRP3 प्रारम्भ, K+ efflux, Ca2+ प्रवाह, वा NLRP3 र ASC बीचको अन्तरक्रियालाई रोक्दैन;यसको सट्टा, यसले ASC oligomerization [27] अवरुद्ध गरेर NLRP3 inflammasome सक्रियतालाई रोक्छ।तसर्थ, हामीले जिआर्डिन इन्जेक्शन पछि NLRP3 इन्फ्लामासोमको भूमिका निर्धारण गर्न भिभो अध्ययनमा MCC950 प्रयोग गर्यौं।सक्रिय क्यास्पेस-1 p10 प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स प्रो-IL-1β र प्रो-IL-18 लाई परिपक्व IL-1β र IL-18 [50] मा काट्छ।यस अध्ययनमा, MCC950 सँग वा बिना जिआर्डिन-उपचार गरिएको मुसामा सीरम IL-1β स्तरहरू NLRP3 इन्फ्लामासोम सक्रिय भएको संकेतको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो।अपेक्षित रूपमा, MCC950 उपचारले महत्त्वपूर्ण रूपमा सीरम IL-1β स्तरहरू कम गर्यो।यी डाटाहरूले स्पष्ट रूपमा देखाउँछन् कि G. duodenalis giardin alfa-2 र giardin alfa-7.3 NLRP3 माउस इन्फ्लामासोम सक्रिय गर्न सक्षम छन्।
गत दशकमा संचित महत्त्वपूर्ण डेटाले देखाएको छ कि IL-17A G. muris विरुद्ध प्रतिरक्षाको मास्टर नियामक हो, IL-17RA सिग्नलिंग, एन्टिमाइक्रोबियल पेप्टाइड्स उत्पादन, र पूरक सक्रियता विनियमित [51]।यद्यपि, Giardia संक्रमण युवा वयस्कहरूमा अधिक बारम्बार हुन्छ, र यो रिपोर्ट गरिएको छ कि जवान मुसाहरूमा Giardia संक्रमणले IL-17A प्रतिक्रिया सक्रिय गर्दैन यसको सुरक्षात्मक प्रभाव [52], अनुसन्धानकर्ताहरूलाई अन्य इम्युनोमोड्युलेटरी Giardia खोज्न प्रेरित गर्दछ।हेल्मिन्थ संक्रमण को तंत्र।हालैको अध्ययनका लेखकहरूले रिपोर्ट गरे कि G. muris ले E. coli EPEC द्वारा NLRP3 इन्फ्लामासोम सक्रिय गर्न सक्छ, जसले एन्टिमाइक्रोबियल पेप्टाइड्सको उत्पादनलाई बढावा दिन्छ र यसको संलग्न क्षमता र आन्द्राको पथमा ट्रोफोजोइट्सको संख्या घटाउँछ, जसले बृहदान्त्रको गम्भीरतालाई कम गर्छ। बेसिलीको कारणले हुने रोगहरू [४९]।NLRP3 इन्फ्लामासोम विभिन्न रोगहरूको विकासमा संलग्न छ।अध्ययनहरूले देखाएको छ कि स्यूडोमोनास एरुगिनोसाले कोशिकाको मृत्युबाट बच्नको लागि म्याक्रोफेजहरूमा अटोफेजी ट्रिगर गर्दछ, र यो प्रक्रिया NLRP3 इन्फ्लामासोम [53] को सक्रियतामा निर्भर गर्दछ।N. caninum को लागि, NLRP3 इन्फ्लामासोमको प्रतिक्रियाशील अक्सिजन प्रजाति-मध्यस्थता सक्रियताले होस्टमा यसको प्रतिकृति सीमित गर्दछ, यसलाई सम्भावित चिकित्सीय लक्ष्य [9] बनाउँछ।Paracoccidioides brasiliensis ले माउस हड्डी मज्जा-व्युत्पन्न डेन्ड्रिटिक कोशिकाहरूमा NLRP3 इन्फ्लामासोमको सक्रियतालाई प्रेरित गर्न पाइन्छ, परिणामस्वरूप भडकाऊ साइटोकाइन IL-1β को रिलीज हुन्छ, जसले होस्ट रक्षामा महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छ [10]।L. amazonensis, L. major, L. braziliensis, र L. infantum chagasi सहित धेरै Leishmania प्रजातिहरूले म्याक्रोफेजहरूमा NLRP3 र ASC-निर्भर क्यास्पेस-1 सक्रिय गर्दछ, साथै Leishmania संक्रमण।NLRP3/ASC/caspase-1 जीन [११] मा मुसाको कमीमा परजीवी प्रतिकृति बढाइन्छ।Zamboni et al।लेशम्यानिया संक्रमणले म्याक्रोफेजहरूमा NLRP3 इन्फ्लामासोमको सक्रियतालाई प्रेरित गर्ने रिपोर्ट गरिएको छ, जसले इन्ट्रासेलुलर परजीवी प्रतिकृतिलाई सीमित गर्दछ।तसर्थ, Leishmania ले बचाउने रणनीतिको रूपमा NLRP3 सक्रियतालाई रोक्न सक्छ।भिवो अध्ययनहरूमा, NLRP3 इन्फ्लामासोम लेशमानियाको उन्मूलनमा योगदान पुर्‍यायो, तर ऊतकहरूलाई असर गर्दैन [54]।यसको विपरित, हेलमिन्थियासिस अध्ययनहरूमा, NLRP3 इन्फ्लामासोमको सक्रियताले जठरांत्रीय हेल्मिन्थियासिस [१२] विरुद्ध होस्टको सुरक्षात्मक प्रतिरक्षालाई दबायो।शिगेला विश्वभर पखाला निम्त्याउने मुख्य ब्याक्टेरिया मध्ये एक हो।यी ब्याक्टेरियाले P2X7 रिसेप्टर-मध्यस्थ K+ efflux, प्रतिक्रियाशील अक्सिजन प्रजाति, लाइसोसोमल अम्लीकरण, र माइटोकोन्ड्रियल क्षति मार्फत IL-1β उत्पादनलाई प्रेरित गर्न सक्छ।NLRP3 इन्फ्लामासोमले शिगेला [55] विरुद्ध म्याक्रोफेजको फागोसाइटोसिस र ब्याक्टेरिसाइडल गतिविधिलाई नकारात्मक रूपमा विनियमित गर्दछ।प्लाज्मोडियम अध्ययनहरूले देखाएको छ कि प्लाज्मोडियमबाट संक्रमित AIM2, NLRP3 वा क्यास्पेस-1 कमजोर चूहोंले टाइप 1 इन्टरफेरोनको उच्च स्तर उत्पादन गर्दछ र प्लाज्मोडियम संक्रमण [56] को लागि अधिक प्रतिरोधी हुन्छ।यद्यपि, चूहोंमा NLRP3 सूजनको रोगजनक सक्रियता उत्प्रेरित गर्न अल्फा-2 giardine र alpha-7.3 giardine को भूमिका अस्पष्ट छ।
यस अध्ययनमा, MCC950 द्वारा NLRP3 इन्फ्लामासोमको अवरोधले BW कम गर्‍यो र मुसाहरूमा आन्द्राको लभेज फ्लुइडमा ट्रोफोजोइट्सको संख्या बढायो, जसको परिणामस्वरूप ड्युओडेनल टिस्युमा थप गम्भीर रोगविज्ञान परिवर्तनहरू हुन्छन्।Alpha-2 giardine र alpha-7.3 giardine ले होस्ट माउस NLRP3 इन्फ्लामासोमलाई सक्रिय पार्छ, माउसको शरीरको तौल बढाउँछ, आन्द्राको लभेज फ्लुइडमा ट्रोफोजोइट्सको संख्या घटाउँछ, र प्याथोलजिकल ड्युओडेनल घावहरूलाई कम गर्छ।यी परिणामहरूले सुझाव दिन्छ कि G. duodenalis ले NLRP3 होस्ट इन्फ्लामासोमलाई alpha-2 giardine र alpha-7,3 giardine मार्फत सक्रिय गर्न सक्छ, जसले मुसाहरूमा G. duodenalis को रोगजनकता कम गर्दछ।
सामूहिक रूपमा, हाम्रा नतिजाहरूले अल्फा-२ र अल्फा-७.३ जिआर्डिनहरूले NLRP3 होस्ट इन्फ्लामासोमको सक्रियतालाई प्रेरित गर्छ र मुसाहरूमा G. duodenalis को संक्रामकता कम गर्छ भनेर देखाउँछ।तसर्थ, यी अणुहरू giardiasis को रोकथामको लागि आशाजनक लक्ष्यहरू छन्।
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
लियांग AKS, लियांग AAM, हुआंग AHC, Sergi KM, Kam JKM।Giardiasis: एक सिंहावलोकन।यो भर्खरै पत्ता लाग्यो कि प्याट इन्फ्लाम ड्रग्स को एलर्जी छ।२०१९; १३:१३४–४३।
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: फार्माकोथेरापीको समीक्षा।एक फार्मासिस्ट को विशेषज्ञ राय।2007;८: १८८५–९०२।
तियान हुआफेंग, चेन बिन, वेन जियानफेंग।Giardiasis, औषधि प्रतिरोध र नयाँ लक्ष्य को खोज।डिसअर्ड ड्रग लक्ष्यहरू संक्रमित गर्दछ।2010; 10:295-302।
वाङ Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, आदि NLRP3 सूजन र सूजन रोगहरू।ओक्साइड मेड सेल Longev।२०२०; २०२०:४०६३५६२।
चेन जीवाई, नुनेज जी। आन्द्राको सूजन र क्यान्सरमा इन्फ्लेमासोमको भूमिका।ग्यास्ट्रोएन्टेरोलजी।2011;१४१:१९८६–९९।
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. क्यानोनिकल र atypical NLRP3 इन्फ्लामासोम सक्रियता प्रतिरक्षा सहिष्णुता र आन्द्राको सूजनको चौराहेमा।पूर्व प्रतिरक्षा।2017; 8:36।
ली एल, वांग एक्ससी, गोंग पीटी, झांग एन, झांग एक्स, ली एस, एट अल।ROS-मध्यस्थ NLRP3 इन्फ्लामासोम सक्रियता N. caninum संक्रमणको प्रतिक्रियामा संलग्न छ।परजीवी भेक्टर।२०२०; १३:४४९।